这一点对于使用siRNA的RNA干扰实验来说毋庸置疑。针对本文,我们特地向Applied Biosystems研发人员询问了关于如何在siRNA实验中合理使用对照的建议。以下是他们的建议。

1、始终使用阳性对照siRNA来监测转染效率。

良好的转染对于使用siRNA有效敲低靶标来说绝对不可或缺。因此在每个实验中使用阳性对照至关重要。阳性对照siRNA应能够在您研究所用的细胞中产生可重复、易检测的敲低效应。只要您发现该对照产生了最大敲低作用,即可确定同一天其他siRNA测试的敲低测量值也是可靠的。

2、了解在最佳转染条件下您的阳性对照siRNA应该产生多大程度的敲低作用。

图1所示数据表明,在实验中使用阳性对照的作用以及了解什么水平的敲低代表“良好”转染的重要性。该实验使用了GAPDH的siRNA,当其被有效转染到HeLa细胞中时,通常可敲低≥97%的靶标(剩余基因表达≤3%)。图1中的数据表明,来自相同实验的敲低作用可在两天中重复。例如,如灰色线条所示,转染未达到最佳效果:GAPDH阳性对照siRNA具有约8%的剩余表达(敲低92%)。请注意,当GAPDH对照siRNA只产生92%的敲低时,实验中的其他siRNA性能不佳。如果我们不知道该对照能够敲低≥97%的靶标,我们可能会错误地认为该实验的转染效果很好,而事实是39个siRNA中只有24个得到了≥70%的敲低效率——这是一个相当低的成功率!在第二个实验中使用完全相同的siRNA,GAPDH对照siRNA产生了>97%的敲低结果(图1,绿色线条)。同样,在所有其他siRNA中,只有一种siRNA的靶标敲低率未达到70%。

图1. 敲低数据表明使用阳性对照监测转染效率的重要性。使用指定的Ambion Silencer Select siRNA进行转染,随后使用TaqMan实时荧光定量PCR检测剩余基因表达。以非靶向阴性对照siRNA转染细胞的表达为基础,对结果进行归一化处理。该实验重复进行2次,如灰色线条和绿色线条所示。应注意,若实验中GAPDH siRNA转染对照的敲低效果较差,则其余siRNA的敲低效率低于被认为有效的阈值,约为20%-30%。在其他实例中(绿色线条),GAPDH的敲低效率在预期范围内(>97%),表明转染具有高效率,其他siRNA的敲低效果也足以产生有意义的结果。

3、使用未标记的siRNA作为转染的阳性对照

理论上,在siRNA实验中,荧光染料标记的siRNA应具有理想的转染对照:仅转染,然后测定内部含有荧光染料的细胞百分比。但是,在实际情况中,可观察到的荧光标记siRNA摄入与相应靶标敲低之间的相关性具有相当大的变异性。由于存在这种可观察到的变异性,我们建议使用未标记的siRNA作为转染的阳性对照。

4、评估阳性对照靶标在RNA水平上的敲低效果

许多阳性对照靶标都具有简单、灵敏的蛋白检测方法,siRNA敲低实验的最终目标是降低靶蛋白表达量。因此,研究人员有时会质疑,通过测量目标mRNA或相应蛋白质产物的减少来评估阳性对照转染是否更好。

由于siRNA在mRNA水平上发挥其作用,所以测量目标mRNA的敲低效果是更为直接的方法。我们建议使用 aqMan基因表达检测和TaqMan基因表达预混液评估mRNA敲低,以获得稳定、可靠的结果。在使用培养细胞的实验中,使用 TaqMan Gene Expression Cells-to-CT™ 试剂盒(包含预混液)能够在未分离RNA的细胞裂解液中直接进行实时RT-PCR检测。

5、使用非靶向siRNA和未转染细胞阴性对照

在RNAi实验中,阴性对照和阳性对照对于获得有意义的数据来说同等重要。在所有实验中,使用至少一种等量的非靶向阴性对照siRNA进行转染——所得数据可作为评估实验靶标敲低的基线。例如,图1所示数据已经进行了归一化处理,其基线为使用非靶向阴性对照siRNA进行转染的细胞内指定靶标的表达量,在该例中,阴性对照为 Ambion Silencer Select 1号阴性对照siRNA。

未转染或仅细胞的阴性对照在siRNA实验中也非常实用。通过对比未转染培养物和使用非靶向阴性对照siRNA转染的培养物中的管家基因表达,可获得关于转染对细胞活力的影响的重要信息。

科学贡献者:
Rajeev Varma, Susan Magdaleno • Applied Biosystems Inc., Austin, TX