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CRISPR背景

CRISPR指的是成簇的、规律间隔的短回文重复序列。在多种宿主生物体中,CRISPR-Cas(CRISPR-相关的)系统被用于基因组编辑。

由于CRISPR-Cas系统高度灵活并且特异靶向,通过操作和调配,可成为基因组编辑的有力工具。CRISPR-Cas技术可用于多种真核生物的靶向基因切割和基因编辑,并且由于CRISPR-Cas系统中核酸内切酶切割的特异性由RNA序列导向,您也可以设计导向RNA序列并且将其与Cas核酸内切酶一起递送到靶标细胞中,从而在基因组任何位点进行编辑。

通过切割与修复机制的结合,TAL和CRISPR可直接编辑基因组产生永久的基因组变化(删除或移码突变),而且产生的基因敲除非常有效。而RNAi技术是通过作用于RNA(编码或非编码)从而下调或者完全关闭基因,是一种间接的方法。由于敲低水平取决于启动子的活性(与整合位点有关),即便在miRNA或shRNA体系稳定表达的情况下,RNAi技术也很难达到完全外显(即shRNA:mRNA的比例)的效果。

作为一种包括Cas9核酸内切酶和非编码的导向RNA(gRNA)的简单双组分体系,经过基因改造的II型CRISPR/Cas体系可用于在预先设定靶向的目标序列处切割基因组DNA。gRNA由两种分子组分:一种靶向互补的CRISPR RNA(crRNA)和一种辅助的反式激活crRNA(tracrRNA)。gRNA和PAM (NGG)基序引导Cas9核酸酶至基因组特定位置,形成复合物,之后局部链分离(R-loop),Cas9核酸酶在PAM 位点上游3个碱基的位置形成一种双链DNA断裂(DSB)。因此,您既可以通过突变赋予靶标基因新的功能,实现敲除效果,也可以引入外来或合成的基因组序列,研究新的应用。

CRISPR也可灵活用于非编辑应用,例如基因调控或者RNAi相关的研究。Cas9核酸酶可以连接到不同的功能域(激活子或者抑制子)上,或者也可以设计gRNA用于直接切割miRNA。

有3种组分:

  • Cas核酸酶Cas9(一种双链DNA核酸内切酶)
  • 一种靶向互补crRNA
  • 一种辅助的tracrRNA

Invitrogen™ GeneArt™ CRISPR核酸酶载体的crRNA和tracrRNA同时表达形成向导RNA,模拟细菌体系中自然存在的crRNA-tracrRNA嵌合体。

 

我们建议对克隆进行分离,然后进行切割分析并对序列进行验证。

HDR(同源修复)和NHEJ(非同源末端连接)都是修复双链DNA损伤的细胞机制。不存在修复模板时,NHEJ用于双链断裂的连接,造成插入/缺失(indel)突变。HDR是另一种模板修复途径,可将序列复制到双链断裂处。因此,通过修复模板进行同源修复,可以将特定的核苷酸变化或者DNA片段引入到目标基因中。

都可以。但为了提高效率,最好使用较长的同源臂(在外源DNA的两端至少500 bp(或更长))。同源长度取决于片段长度且需要测试。ssDNA可能更容易出错或选择NHEJ途径进行修复。针对这种应用,我们提供Invitrogen™ GeneArt™Strings™ dsDNA片段(1–3 kb)。

利用 GeneArt CRISPR核酸酶载体引起双链DNA断裂,同时转染基于质粒的供体修复模板。您的供体修复模板质粒将会包含希望引入的序列并在两端具有至少500bp(或更长)的序列,从而实现序列的高效同源重组。

HDR效率非常低,平均不到2%。

仔细设计crRNA用于靶向寡核酸以及避免与基因组上其他区域同源,是减少脱靶效应的关键。

可以,将CRISPR技术与HDR结合使用将使之成为可能。

最好先针对前几个外显子进行设计(靠近启动子,导致转录提前终止)。由于gRNA效率取决于位点的易用性和该位点的染色质结构,通常建议设计和测试几个不同的靶向位点。从未经CRISPR处理的细胞中分离gDNA作为对照,通过 检测实验可鉴别出非CRISPR相关的突变。标准免疫印迹分析是验证蛋白表达水平的最佳方法。

Invitrogen™ GeneArt™ CRISPR 核酸酶用户指南中的gRNA寡核苷酸设计策略阐释了设计gRNA需要定点插入新霉素抗性基因的方法。在新霉素抗性基因上连上位点特异的同源臂,就可以通过HDR插入新霉素抗性基因。

A single guide RNA (gRNA) is all that is required for targeting, but we do recommend that 2 or 3 gRNAs are tested against each locus being targeted for cleavage. Testing multiple gRNAs increases the chances of finding a gRNA with high editing efficiency. 

提供,相关问题请联系custom.services@lifetech.com咨询,我们将协助您进行项目设计并提供报价。

我们仅在哺乳动物体系(人和小鼠细胞)中检测过CRISPR体系。

也许可以,但我们的体系不是针对原核生物设计的,仅仅针对哺乳动物体系进行了优化。请咨询我们的CRISPR客户服务(custom.services@lifetech.com)详细咨询。

Cas9仅瞬时表达,会随着时间和细胞分裂而消失。

对于mRNA,我们最早在转染24小时后开始观察到敲低效果,在48-72时后观察到更高的敲低效果。

切割具有较高的精确度,在Cas9和gRNA复合物结合到靶向基因组序列后,在PAM (NGG)位点上游3个碱基的位置处发挥核酸酶活性。

因为特定位点的切割效率取决于位点的易用性、染色质状态和序列,建议检测目标基因中的多个不同位点/区域。利用CRISPR-Cas9进行基因组编辑,对于不同的靶标,用户只需要改变19–20 bp的靶标特异性寡核苷酸。经过筛选细胞系并鉴别切割效率最高的序列/位点之后,可通过高特异性的Invitrogen™ GeneArt™ TALs精确创建生物学相关的突变。

Indel指的是基因组中的碱基插入或缺失,可以通过NHEJ或HDR修复过程引入细胞。

Our CRISPR products are optimized for mammalian systems, and have not been optimized for plant systems. However, we know researchers are doing that kind of work. While we have not tested our CRISPR products for plants, our new protein format would be ideal since it does not need to be translated and transcribed in the cell, so no plant-specific promoters required.

For transfecting of the Cas9 protein, we would recommend using the Neon™ transfection system or Lipofectamine™ CRISPRMAX™ Cas9 Transfection Reagent. For transfection of mRNA, we would recommend using Lipofectamine™ MessengerMAX™ Transfection Reagent. For transfection of CRISPR vectors, we would recommend using Lipofectamine™ 3000 Transfection reagent.

The only complete way to confirm that there are no off-target effects is to sequence the entire genome of your cell. Alternatively, a less thorough means of checking for off-target editing is to perform targeted sequencing of sequences with the highest probability of off-target effects (i.e., most similar to your CRISPR target region).

GeneArt CRISPR核酸酶载体

在哺乳动物细胞以及没有启动子限制的情况下,建议使用GeneArt CRISPR核酸酶载体体系。而对于难转染的细胞系,显微注射以及需要同时靶向多个靶点时,建议使用GeneArt CRISPR核酸酶mRNA体系。

该体系使得您可以通过单个质粒,以序列特异性方式编辑和改造所选的基因组位点。我们提供两种载体,分别表达OFP报告基因和CD4,便于通过流式或者Invitrogen™Dynabeads™技术筛选和富集细胞。这两种试剂盒都包括一体化的载体,可以同时表达非编码导向RNA(包括crRNA和tracrRNA)和Cas9核酸内切酶。

5’端非磷酸化的脱盐纯化的寡核苷酸是可以的。当然,HPLC或更高纯度的寡核苷酸将会增加双链寡核苷酸克隆到GeneArt CRISPR核酸酶载体的效率。

可以用无核酸酶的水或TE缓冲液进行重悬,但如果您要进行退火反应,请使用合适的寡核苷酸退火缓冲液进行退火。随后,请用终浓度1X的寡核苷酸退火缓冲液对引物做系列稀释。

我们的载体包含了一个CMV启动子,可驱动Cas9核酸内切酶的表达。

OFP报告基因表达的荧光方便追踪转染效率,同时支持通过FACS法分选/富集表达Cas9和CRISPR的细胞。

转染了带有CD4报告基因的GeneArt CRISPR核酸酶载体的细胞群可以使用流式或者Invitrogen™ Dynabeads™ CD4磁珠进行富集。

可以先设计两条单链DNA寡核苷酸 (24–25 bp),一条编码靶向特异性crRNA(正向链寡核苷酸),另一条是其互补的序列(反向互补链寡核苷酸)。然后您可以简单地通过退火制备双链寡核苷酸,将其克隆到试剂盒中提供的线性化的载体中。以下是我们提供的一些指导准则:

  • 长度:靶序列的长度在19-20nt之间,3´末端紧邻NGG(PAM)序列。通过U6PolIII启动子启动转录所需的5´G已经包含在载体的突出末端中,不需要包含在靶向序列中。注:不要在寡核苷酸引物中引入PAM序列。
  • 同源性:确保靶向序列与其他基因没有明显的同源性,否则可能会增加脱靶效应。最近发表的研究成果表明,gRNA-Cas9复合物可以容忍1–3个或者更多的错配,具体因其在gRNA中的位置而异。有关如何选择靶向序列的更多信息,请参考文献(Fu et al., 2013; Mali et al., 2013)。
  • 方向:您选择的靶向序列可能编码靶向位点的有义序列,也可能编码其反义序列。因此,您制备出的CRISPR RNA可能有两个朝向,在其3´端都有PAM序列。

可以,我们同时提供含有或不含感受态细胞的试剂盒。当然,该载体优化时采用的是Invitrogen™ One Shot™ TOP10化学感受态,这种感受态专用于高效克隆、质粒扩增以及高拷贝质粒的稳定复制。请注意,使用不同基因型的感受态细胞可能会降低克隆效率,并且会产生较高比例的未插入载体。

通过测序确定插入到阳性转化子中的双链寡核苷酸的一致性。分析每一个CRISPR核酸酶重组子以确定:

  • ds寡核苷酸插入物是存在的,并且方向正确;
  • 插入的双链寡核苷酸序列是正确的

注:由于双链寡核苷酸插入物太小,不建议进行限制性酶切分析。

建议使用 Invitrogen™PureLink™HiPurePlasmidMiniprep试剂盒来制备高质量的DNA。请务必确保DNA中不含苯酚或者氯化钠污染。

转染方法因细胞类型而异。为了在大多数的哺乳动物细胞系中实现高效转染,我们推荐采用基于阳离子脂质体的 Invitrogen™ Lipofectamine™ 3000试剂

恰当储存的情况下,所有试剂可保证6个月内性质稳定。载体、缓冲液、对照寡核苷酸、质粒,水以及测序引物应储存在–20°C。

gRNA表达由Pol III U6启动子驱动。

OFP的激发峰为548 nm,发射峰为560 nm。我们建议采用488nm激光进行高效的激发,建议采用530/30、647/26和603/48发射滤光片进行检测。

可以通过GeneArt基因组切割检测实验检测切割效率。该实验通过可以识别错配的核酸内切酶来检测细胞内NHEJ修复过程中产生的插入和缺失(indel)。

将CRISPR-Cas9载体,以及修复模板转染入细胞,其中修复模板中含有与目的序列高度同源的序列以及需要导入的DNA序列。这样,就可以通过HDR将特异性编辑(突变、插入等)引入基因组了。

PAM具体是指前间区序列邻近基序,是Cas9成功结合到DNA上所必需的。GeneArt CRISPR试剂盒中Streptococcus pyogenes(酿脓链球菌)Cas9的PAM序列就是NGG。

不可以,对细菌来说,用于Cas9的PAM序列是特定的。GeneArt试剂盒中的Cas9来源于 Streptococcus pyogenes(酿脓链球菌)。

可以,如果您使用目前的GeneArtCRISPR核酸酶载体,请留意对应的有限使用商标许可(LULL)。

GeneArt CRISPR核酸酶mRNA体系

该试剂盒包含一个可直接转染的野生型Cas9 mRNA,可用于进行CRISPR-Cas9介导的基因编辑。Cas9 mRNA在各种实验中主要以两种形式应用:

可直接转染形式:Cas9 mRNA直接与定制的Invitrogen™ GeneArt™ CRISPR U6 Strings™ DNA或者其它方式合成的gRNA表达元件共转染。

完整的RNA形式:Cas9 mRNA与体外转录gRNA共转染。如果需要体外转录gRNA,模板可以采用Invitrogen™ GeneArt™ CRISPR T7 Strings™ DNA 或者其他定制模板。

转染之后,通过gRNA上的crRNA序列,将Cas9蛋白(由mRNA产生)引导到基因组特定位点,进行所需的基因组编辑。

在大多数检测过的细胞类型中,相对于质粒形式,完整的RNA形式表现出更高的切割效率。另外,Cas9 mRNA形式避免了克隆的需要,负载更小,便于优化Cas9/gRNA剂量比,可以灵活地对多个靶点同时进行编辑,且不存在任何启动子相关的限制。

CRISPR mRNA体系包含可直接转染的野生型Cas9 mRNA,没有细胞特异性启动子限制。

请填写此 并发送到 geneartsupport@lifetech.com

含有,GeneArt CRISPR Strings DNA定制时可以选择U6或T7启动子。

可以,如果您有自己的表达体系,就不必订购GeneArt CRISPR Strings DNA了。

使用Invitrogen™ Lipofectamine™ MessengerMAX™ 试剂对GeneArt CRISPR U6 Strings DNA 和GeneArt CRISPR核酸酶mRNA进行共转染。转染48–72小时后,通过GeneArt 基因组切割检测实验或测序分析样品的基因修饰情况。

为了产生即用型体外转录的gRNA,建议使用我们的 Invitrogen™ Megashortscript™ T7 转录试剂盒

我们建议采用LipofectamineMessengerMAX试剂。

针对您选择的靶标创建多个U6 Strings DNA,然后将它们与GeneArt CRISPR核酸酶mRNA共转染。

我们已经在在多个细胞系中试用了我们的mRNA核酸酶CRISPR体系,其中包括:293细胞、HeLa细胞、U2OS细胞、HCT116细胞、小鼠neuro-2a细胞、小鼠ES细胞、iPS细胞、K562细胞、Jurkat细胞、CHO细胞和A549细胞。

对于24孔板规格,我们建议的起始比例为每孔0.5 µg Cas9 mRNA:50 ng IVT gRNA。建议您通过剂量反应实验确定对于特定细胞系的最佳比例。

可以,Neon体系可用于多重gRNA转染。

GeneArt™ CRISPR nuclease mRNA is a ready-to-transfect, mammalian codon-optimized Streptococcus pyogenes Cas9 nuclease mRNA that is properly capped and polyA-tailed for stability and high expression. The smaller payload of GeneArt™ CRISPR nuclease mRNA allows for single or multiplex gRNA delivery for CRISPR-mediated genome editing applications. High genome editing efficiency can be achieved when both CRISPR mRNA and gRNA are delivered with Lipofectamine™ MessengerMAX™ Transfection Reagent.

We recommend using a positive gRNA control with the GeneArt™ CRISPR nuclease mRNA to ensure that your transfection reagent was efficiently delivered to your cells. We have a functionally validated in vitro transcribed HPRT gRNA control available from our Custom Services group (send an email to custom.services@lifetech.com). Either the GeneArt™ Genomic Cleavage Detection Kit (Cat. No. A24372) or GeneArt™Genomic Cleavage Selection Kit (Cat. No. A27663) may be used to confirm genomic cleavage activity by Cas9 nuclease.

Lipofectamine™ MessengerMAX™ Transfection Reagent is especially formulated for the delivery of both mRNA and gRNAs for all cell types (easy or difficult-to-transfect, primary, and stem cells).

When the GeneArt™ CRISPR nuclease mRNA is used with the GeneArt™ Genomic Cleavage Selection Kit (Cat. No. A27663), both Cas9/gRNA ribonucleoprotein function and edited cells can be simultaneously confirmed by either OFP or CD4 selection.

GeneArt™ Platinum Cas9 Nuclease

The buffer composition for the Platinum Cas9 protein is as follows: 

10 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.6 mM TCEP, 50% glycerol.

Please note that we can make custom formulations if necessary.

We recommend using the Neon™ Transfection System or the Lipofectamine™ CRSIPRMAX™ Cas9 Transfection Reagent. 

The molar ratio of IVT gRNA to Cas9 protein should be approximately 1.2:1. 

Guide RNA (gRNA) Synthesis

No other kits are required for this process. All necessary components are included in the kit.

The Precision gRNA Synthesis Kit (Cat. No. A29377) includes primers for synthesis of gRNA targeting safe harbor locus HPRT. We also have a fully processed, fully validated HPRT gRNA with GCD primers for confirmation of cleavage available from our custom services team.

CRISPR Transfection

Although the Lipofectamine CRISPRMAX Reagent was developed for the delivery of the Cas9-gRNA ribonucleoprotein, there is potential for other protein complex applications.

The Lipofectamine CRISPRMAX Reagent was developed to efficiently deliver the Cas9-gRNA ribonucleoprotein complex. We recommend that you first deliver the donor plasmid with Lipofectamine 3000, then follow with delivering the Cas9-gRNA complex with Lipofectamine CRISPRMAX Reagent for best editing efficiency.

The Lipofectamine CRISPRMAX Reagent combined with the proprietary enhancement properties of the Lipofectamine Cas9 Plus Reagent leads to efficient complex formation with the Cas9-gRNA ribonucleoprotein, for best delivery to the nucleus, helping to ensure high gene editing frequency for a wide range of cell types.

Please see the Lipofectamine CRISPRMAX Reagent manual for protocol details or contact techsupport@thermofisher.com.

The Lipofectamine CRISPRMAX Reagent combined with the proprietary enhancement properties of the Lipofectamine Cas9 Plus Reagent leads to efficient complex formation with the Cas9-gRNA ribonucleoprotein, for best delivery to the nucleus, helping to ensure high gene editing frequency for a wide range of cell types.

Please see the Lipofectamine CRISPRMAX Reagent manual for protocol details or contact techsupport@thermofisher.com.

Invitrogen™ GeneArt™基因组切割筛选试剂盒

GeneArt基因组切割筛选试剂盒可用于:

  • 转染24小时之后,利用荧光显微镜检测您所构建的核酸酶功能。
  • 利用流式或者Dynabeads CD4磁珠富集被修饰的细胞。

试剂盒中的载体上插入了一个克隆位点,打断了OFP基因,这个克隆位点用于插入靶向序列。编码OFP的基因N端部分的序列中包含一个与OFP基因C端部分的5’末端互补的区域。OFP序列N端后的终止密码子确保核酸酶激活前不表达报告基因。当OFP基因在克隆位点被打断时,CD4基因不在读码框中故不能表达。双链断裂引起了OFP基因末端序列的互补链重组,同时OFP恢复表达。这样CD4基因也就能同框表达并可通过流式分析或者Dynabeads磁珠进行筛选了。

可以,GeneArt基因组切割筛选试剂盒可用于对TALs和/或CRISPR效率进行检测。

请见下表中的比较结果:

GeneArt基因组切割筛选试剂盒 GeneArt基因组切割检测试剂盒
快速,活细胞检测 需要裂解细胞
目测指示(荧光) 可量化结果
证明编辑工具有效 对于阴性结果无法判断编辑工具是否有效
允许克隆富集 无富集能力

最早可在转染后24小时验证切割,具体的操作方式为在显微镜下通过检测转染细胞的OFP表达来验证切割。OFP阳性细胞的比例可以指示TAL或CRISPR-Cas9切割活性。

GeneArt基因组切割筛选载体同时包含膜蛋白CD4编码基因,能够通过T2A自切肽与OFP融合,从而可通过细胞分选或者偶联了CD4抗体的Dynabeads富集核酸酶修饰了的细胞。该切割筛选载体可简单、快速地评估核酸酶的功能,同时可直接富集基因组发生了修饰的细胞。

OFP和CD4表达可以作为一种估测方法,而不是对基因组切割效率做绝对量化。建议使用我们的GeneArt基因组切割检测试剂盒来验证内源性基因组位点的切割。

OFP的激发峰为548 nm,发射峰为560 nm。建议采用488 nm的激光进行有效激发,采用标准的530/30, 574/26和603/48发射滤光片进行发射检测。

Invitrogen™ GeneArt™基因组切割检测试剂盒

GeneArt基因组切割检测试剂盒为位点特异性双链DNA断裂提供了一种简单、可靠且快速的检测方法。该技术利用能识别错配的内切酶来检测细胞的NHEJ修复过程中引入的基因组插入或缺失(indel)。

该检测体系所采用的基因组DNA是从转染了表达核酸酶的元件的细胞中提取的。切割之后,在细胞的修复机制下产生了插入和缺失,通过PCR对出现基因特异性双链断裂的位点进行扩增。PCR产物经过变性和再退火产生错配,因为含有插入/缺失的序列再退火后,不含插入/缺失的链会和含有插入/缺失的序列退火产生错配。错配随后被检测到并被检测酶切割,切割产生的条带即可通过凝胶电泳和条带的灰度值进行分析。

待研究的基因组DNA位点在检测前必须进行PCR扩增。请遵照以下推荐的指导原则,确保最佳的扩增和后续检测效果:

  • 为了获得最佳的结果,请使用Tm>55°C的引物。
  • 引物设计长度要介于18–22 bp之间,且GC含量介于45–60%之间。
  • 为有效扩增,设计引物产生的扩增子长度要介于400到500 bp之间。
  • 引物设计时潜在的切割位点不能在扩增子的中心位置,同时检测反应需要能够产生两个明显的产物条带。

请使用以下公式:

切割效率= 切割的片段 =切割的条带强度的总和/(切割的和未切割的条带强度的总和)

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