分离完整的RNA在基因表达分析所用的众多技术中是必不可少的。有很对技术可以用于基因表达分析,对于这些技术而言,分离得到完整的RNA是必不可少的一步。Northern分析,cDNA文库构建以及用于微阵列芯片分析的cDNA标记实验(尤其在使用oligo(dT)作为引物时)均要求RNA具有高度的完整性。而RT-PCR与核糖核酸酶保护实验均涉及到对较短序列区域的分析(通常短于1kb),因此较易接受部分降解的RNA。不论具体的下游应用是什么,进行基因表达分析之前检查RNA完整性都是有意义的。

琼脂糖凝胶

评估总RNA完整性的最常用的方法是使用少量的RNA样品进行变性凝胶电泳并用溴化乙锭(EtBr)进行染色。虽然使用非变性凝胶电泳也是可以的,但其结果可能较难解读。RNA的二级结构会改变其在非变性凝胶中的迁移模式,从而使RNA不会按真实片段大小进行迁移。非变性环境同样会使条带不那么清晰,甚至会产生多条带分别对应于同一种RNA的不同结构。

完整的总RNA在进行变性凝胶电泳时会产生清晰的28S和18S rRNA条带(真核样品)。28S rRNA条带的强度应当大致为18S rRNA条带的两倍(图1,第3条泳道)。这种2:1的比率(28S:18S)是判断RNA完整性的一个很好的指标。部分降解的RNA样品电泳条带会弥散,没有清晰的rRNA条带,或者不会出现前面提到的高质量RNA才具有的2:1比率(28S:18S)。完全降解的RNA会表现为在极低分子量处的弥散状(图1,第2条泳道)。电泳中加入RNA分子量标志物可以帮助确定条带或弥散对应大小,也可以帮助判断电泳是否正确进行(图1,第1条泳道)。注意:利用Poly(A)进行进一步纯化得到的样品不会带有明显的rRNA条带,而是会表现为6kb到0.5kb大小范围的弥散(mRNA的集合,具体范围与曝光时间和环境有关),其中1.5到2kb的区域亮度最强(这一弥散有时也会出现在总RNA样品中)。



图1:完整的RNA与降解的RNA之间的比较。 分别取2微克的降解总RNA及完整总RNA与Ambion的RNA Millennium Markers™一同进行1.5%的变性琼脂糖凝胶电泳。在完整RNA样品中可以清楚地观察到18S和28S核糖体RNA。而降解的RNA则表现为较低分子量的弥散。

灵敏度

使用变性凝胶电泳来评估RNA完整性的一个缺陷是观察所需的RNA样品量。通常情况下,需要在变性凝胶中上样至少200 ng的RNA才能在EtBr染色下进行观察。而在某些RNA制备实验中,如从穿刺活检样品或激光捕获显微切割样品中提取RNA,得率是非常低的。这种情况下,或许就不可能在进行表达谱分析实验前取出200ng的RNA来评估其完整性。其它的核酸染料,比如Moleculor Probes (Eugene, OR) 的SYBR® Gold及SYBR Green II RNA染料,相比传统的琼脂糖凝胶电泳EtBr染色方法可以显著提高灵敏度。通过使用300nm的透射光源(6 x 15瓦的灯泡)及特殊的滤光片,SYBR Gold RNA凝胶染色可以检测到低至1ng的RNA,而SYBR Green II则可以检测到2ng,从而可以使用更少的样品来进行RNA完整性分析。



图2:该图为高质量的真核总RNA样品的电泳图。在39秒及46秒位置分别可以观察到清晰的18S和28S峰。Bioanalyzer的微通道充满了筛孔高分子聚合物和荧光染料。样品可以通过其发出的荧光而被检测到,其信号可转换为电泳峰图或类凝胶电泳图像(数据未显示)

 

琼脂糖凝胶分析的替代方法

目前有一种快速简单的方法可以替代传统的凝胶分析方法,这种方法可以同时对RNA样品进行定量及质量评估。Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies)是第一款商业化的提供RNA样品状态细节信息的微流体仪器。当与RNA 6000 LabChip®(Caliper Technologies Corporation所拥有的一个注册商标)结合使用时,每次进行分析最低仅需1µl浓度为10 ng/µl 的样品。除了评估RNA完整性,这台自动化系统同样可以提供样品RNA浓度及纯度(如mRNA制备中的rRNA污染)的评估。在过去,检测浓度及纯度需要使用部分RNA样品(通过A260分光光度法),而评估完整性则需要另外使用部分样品。通过使用LabChip®系统,可以仅使用一份5ng的样品来同时对浓度、完整性及纯度进行分析。分析数据可以显示为类凝胶图像、电泳峰图(图2)及表格形式等。