QuantStudio Real-Time-PCR-System – Beispieldaten

Überblick

Applied Biosystems QuantStudio Real-Time-PCR-Systeme können sogar noch nur 1,5-fache Änderungen nachweisen. Die meisten Systeme ermöglichen zudem eine reproduzierbare Trennung über 10 Größenordnungen der eingesetzten Template-Menge.

Die Software umfasst ein Online-Toolkit für die Analyse der mit QuantStudio Systemen gewonnenen Daten. Die Software nutzt Connect, unsere Cloud-basierte Plattform, zur Bereitstellung äußerst vielseitiger Analysetools, die flexibel, schnell und anwenderfreundlich sind und das funktionale Verständnis der qPCR und zugehöriger Daten erleichtern.

Mit diesen Modulen können Anwender über 100 Genotypisierungen, Genexpressionen oder andere qPCR-Experimente in einem Projekt kombinieren und die Daten innerhalb weniger Minuten analysieren. Zu den enthaltenen Modulen gehören Design und Analyse, hochauflösende Schmelzkurvenanalyse (HRM), Anwesenheits-/Abwesenheitsanalyse, Standardkurve, Genotypisierung, hPSC ScoreCard Analyse und relative Quantifizierung. Siehe nachstehende Beispiele.

Empfindlichkeit

Nachweis von selbst 1,5-facher Diskriminierung

Ausgeprägte Cluster, die auf eine 2-fache und 1,5-fache Diskriminierung auf dem QuantStudio 7 Pro System mit einem Konfidenzniveau von 99,9 % hinweisen, was der anderer Applied Biosystems Plattformen, QuantStudio 7 Flex und der 7900HT Geräte entspricht. Es wurden Gesamt-Leber-cDNA-Proben mit 2-fachen und 1,5-fachen Unterschieden in der Eingabe untersucht. Die Läufe wurden mit der Software der jeweiligen Plattform, mit automatischem Schwellenwert und Basislinie, analysiert, dann exportiert und mit der statistischen Software SAS JMP v13 analysiert.

Das Amplifikationsdiagramm zeigt den Nachweis von 1,5-fachen Änderungen bei der Expression mit dem QuantStudio 7 Pro System. Eine Verdünnungsreihe des KAZ-Plasmids wurde amplifiziert. Auf der vertikalen Achse ist die Änderung der Fluoreszenz, normalisiert auf den ROX Farbstoff, dargestellt. Die horizontale Achse zeigt die zunehmende Zyklusnummer von links nach rechts. Dies wird durch die grafische Darstellung als Standardkurve verifiziert. Die vertikale Achse der Standardkurvendarstellung ist der Zyklusschwellenwert, die horizontale Achse die Verdünnungsreihe, die in der Konzentration von links nach rechts ansteigt.

Die Amplifikation der KAZ-Plasmid-DNA in 10-fachen Verdünnungen wurde mit dem 96-Well-Block durchgeführt und zeigt eine hochgradig reproduzierbare Trennung über die 10 Größenordnungen der eingesetzten Template-Menge. Die vertikale Achse zeigt die logarithmische Darstellung der Fluoreszenz, normalisiert auf den ROX Farbstoff, nach Subtraktion des Hintergrunds. Die horizontale Achse zeigt die zunehmende Zyklusnummer von links nach rechts.

Einzelkopienachweis

Einzelkopien des KAZ-Plasmids in Blau im Vergleich zu NTC in Violett. Das QuantStudio 7 Pro System erkennt durchgängig eine einzelne Kopie, die deutlich von NTCs (43/48 positive Wells) unterschieden werden kann.

Multiplexing

Die Multiplex-Reaktion weist mit VIC Farbstoff markierte 18S rRNA und TGFb-Gen mit FAM markierten TaqMan Sonden und Primern nach. Die Reaktion verwendete den schnellen Mastermix und wurde in 96 Replikaten ausgeführt. Die vertikale Achse gibt die Änderung der Fluoreszenz auf den ROX Farbstoff normalisiert wieder, während auf der horizontalen Achse die ansteigende Zyklenanzahl von links nach rechts dargestellt ist. Die C_T-Werte zeigen eine klare, konsistente Trennung der Produkte mit einer geringen Standardabweichung zwischen den Replikaten.

Genotypisierung

Diese Diagramme zeigen, wie verbesserte Visualisierungen und grafische Darstellungen der allelischen Diskriminierung in der Genotypisierung-App die wahren Signale gegenüber dem Hintergrundrauschen genau wiedergeben.

Hochauflösende Schmelzkurvenanalyse (High Resolution Melt Analysis, HRM)

Die HRM-App wurde für die Post-PCR-Analyse zum Nachweis von Variationen in Nukleinsäuresequenzen entwickelt. Die Methode erkennt kleine Unterschiede in PCR-Schmelzkurven (Dissoziationskurven) mithilfe extrem heller, dsDNA-bindender Farbstoffe in Verbindung mit QuantStudio Systemen. Aufgrund der präzisen Temperaturrampensteuerung des Systems, der erweiterten Funktionen zur Datenerfassung und der HRM-Analysesoftware ist es hervorragend für die HRM-Analyse geeignet.

Nur für Forschungszwecke. Darf nicht für diagnostische Verfahren eingesetzt werden.