DNA-free™ DNase Treatment & Removal Reagent包括无RNase的DNase以及优化的DNase消化缓冲液,能确保安全、完全地去除RNA样品中的污染DNA。该试剂还包括一种独特的DNase Removal Reagent ,可在消化后数分钟内去除DNase,因此无需进行操作繁杂且容易造成RNA损失或降解的苯酚萃取或热灭活等步骤。

RNA制备过程中的污染DNA可在PCR过程中作为模版,从而使RT-PCR得到假阳性结果。尽管通过观察无逆转录对照结果可以很容易地判定假阳性结果,但去除污染DNA仍然是非常重要的。本文我们将讨论RT-PCR过程中基因组DNA污染问题、检测和去除DNA污染的最佳方法,以及在进行DNase I处理后去除DNase I的创新方法。

所有提取方法都会有DNA污染

在不使用DNase的情况下,所有RNA提取方法都无法保证得到无基因组DNA污染的RNA。为了说明这一点,我们对利用了不同提取方法得到的小鼠肝脏RNA进行了RT-PCR。


图 1.使用5种不同方法提取得到的RNA中的DNA污染情况。我们使用如图所示的不同方法提取小鼠肝脏中的总RNA,然后对0.5ug RNA进行如图所示的RT-PCR或PCR(无逆转录),之后各取一份反应液在2%的琼脂糖凝胶上进行电泳并进行溴化乙锭染色。

RNA提取方法

  1. 单一试剂提取法(如TRIzol® Reagent (Invitrogen)、TRI Reagent® (MRC)、RNAzol® (Tel-Test)、RNA Stat-60® (Tel-Test)、RNAwiz™ (Ambion))
  2. 玻璃纤维滤膜结合法(如RNeasy® (Qiagen)、RNAqueous® (Ambion))
  3. 多步骤的硫氰酸胍/酸酚氯仿提取法(如Chomzynski 和 Sacchi 步骤和Ambion's ToTALLY RNA™ 试剂)。
  4. CsCl密度梯度离心法
  5. 两轮oligo d(T)筛选法(如FastTrack® RNA (Invitrogen)和Poly(A)Pure™ Kit (Ambion))
  6. 水对照



从图1可以看出,不管是哪种提取方法,在无逆转录酶的情况下都会有基因特异性产物的合成,这意味着这些RNA提取方法都不能得到无DNA污染的RNA。

如何知道所提取到的RNA中有DNA污染?

如何检测RNA样品中是否有DNA污染?最好的办法是在RT-PCR实验中为每个RNA样品提供无逆转录对照。如果PCR产物来自于未经逆转录的RNA样品(无逆转录对照),则该产物即是由污染DNA的扩增而来。污染DNA既可能来源于RNA制备过程,也可能来源于RT-PCR中所用的试剂。设置无模板的PCR对照可以很好地区分这2种情况。

可以设计PCR引物来作为基因组DNA污染分析的对照。可扩增内含子-外显子区域的引物能够扩增含有内含子的污染DNA的产物,且比预期的cDNA产物更大。实际上,可以优化引物设计,使其几乎不能扩增基因组片段。然而,单纯依赖引物设计来检测DNA污染有时是不够的。若样品中含有假基因,则假基因也可以得到与预期cDNA产物相同大小的扩增产物(例如,假基因可能来自经过剪切等修饰的mRNA,在反转录后整合回基因组中,因此不含内含子)。图2描述了如何设计引物来检测大多数DNA污染,以及为什么在所有RT-PCR实验中仍然需要无逆转录对照。


图 2. 检测RNA中的DNA污染。 使用小鼠肝脏RNA (0.5 µg) 作为RT-PCR模板,S15 PCE引物可以扩增出内含子-外显子产物。在无逆转录对照反应中检测到了来自基因和假基因的产物。

去除污染DNA并用DNase破坏

几乎所有的RNA样品都有DNA污染,因此大多数实验方案在RT-PCR实验中会用到DNase。DNase I显然是去除RNA样品中DNA污染的最好办法。然而,有些DNase在制备过程中会被RNase污染。另外,在RT-PCR之前必须使DNase完全失活,以免降解新合成的DNA。不幸的是,去除或失活这种酶会带来很多问题,DNase去除方法操作起来不方便、效果不佳,甚至会损伤到RNA的完整性。

常用的去除或失活消化处理后的DNase的方法包括:热灭活、蛋白酶K处理后进行酚氯仿提取、EDTA螯合其发挥作用所必须的阳离子以及利用玻璃纤维滤膜结合法纯化(如RNAqueous®,参见下文中的“用于RT-PCR的RNA提取”)。但是这些失活或去除方法都有各自的缺点。

热灭活: 热灭活可能是最常用的失活DNase的方法,只需在75°C处理5分钟。尽管这种方法直接简单,但加热时DNase消化缓冲液中的二价阳离子会引起化学诱导的RNA链剪切。Ambion的研究发现,在含有2.5 mM MgCl2和0.1 mM CaCl2(DNase I消化缓冲液中经典的盐离子组分)的条件下,在80°C加热5分钟后,多数RNA样品都会被破坏。

蛋白酶K处理和有机提取: 先进行蛋白酶K处理然后进行酚氯仿提取可能是最严格的去除和失活DNase的方法,但这种方法非常耗时,且有机提取通常会造成样品损失。虽然之后可以通过酚氯仿相的再提取来最大限度减少样品损失,但对于本来就耗时的流程而言这又新添了一个步骤。此外,许多研究人员会尽量避免操作有害的酚试剂。

EDTA螯合阳离子: 在DNase消化反应液中加入EDTA,可以螯合DNase I保持活性所必需的离子,这样可以很快使DNase I安全失活,并且不会造成RNA损失。然而,逆转录酶和热稳定的DNA聚合酶都需要Mg2+来保持活性,因此在酶促反应前必须加入额外的离子使EDTA的螯合能力达到饱和,再进行后续的酶促反应。而这会使本来简单的反应变得复杂。

RNA纯化: 一些使用滤膜的RNA提取法会在滤膜与裂解液结合后直接处理DNase。这种处理方法可能无法完全去除污染DNA,因为DNase不会处在最优的消化环境中(痕量的裂解液及其他污染物可能会干扰最优的消化环境)。也可对使用DNase处理的RNA制备溶液进行纯化,分离出其中的DNase。然而这种技术虽然能充分去除DNase,但需要额外的步骤以及昂贵的材料。

用于RT-PCR的RNA提取

使用RNAqueous®-4PCR Kit,可以从小至100个细胞或1mg组织的样品中提取得到无基因组DNA污染的RNA。该试剂盒包含用于无酚提取RNA的试剂以及去除污染DNA的试剂,另外还包括研磨小组织样品的塑料棒,能配合离心管进行研磨。RNAqueous的提取步骤包括在胍盐裂解液中破碎组织或细胞、结合RNA至玻璃纤维滤膜上、清洗滤膜上的污染物、加入少量洗脱液回收RNA以及使用试剂盒中的DNase处理和去除试剂处理,最终得到可用于RT-PCR的RNA。

使用由RNAqueous®-4PCR Kit提取得到的总RNA进行RT-PCR实验。以RNA为模板,分别进行RT反应及不含逆转录酶的假RT反应。使用S15引物对以上反应中得到的十分之一的cDNA进行扩增。在无逆转录反应中没有发现PCR产物,表明使用Ambion的RNAqueous-4PCR Kit提取到的RNA中没有DNA污染。分子量标准品右边的电泳区带显示了来自样品的S15 RT-PCR产物。

DNA-free先去除DNA,再去除DNase

DNA-free DNase Treatment & Removal Reagent是Ambion最新推出的用于简化用于RT-PCR的RNA的制备的工具,可以去除任何RNA中的基因组DNA污染,并且不会造成RNA损失或降解。该试剂包含RNase-free DNase I以及优化的DNase Reaction Buffer,可完全消化RNA样品的中的污染DNA。Ambion的DNase I使用超纯试剂制备,我们在确认其能非常有效地去除DNA及失活RNase之后才将其推出上市。10X DNase Reaction Buffer设计用于发挥DNase I的最佳活性。DNA-free还包含一种创新的DNase Removal Reagent,可以在DNase处理完成后快速去除DNase。该试剂在DNA消化完成后,可有效去除反应液中所有的痕量DNase和二价阳离子。DNase/离子去除步骤非常快,仅三分钟就可完成。DNase消化完成后,加入Removal Reagent并摇匀,然后在室温下孵育2分钟。待DNase Removal Reagent与DNase和离子结合后,对DNase Removal Reagent进行快速离心,使RNA保留在上清用于后续的RT-PCR。该简易方法无需进行麻烦的有机提取或对DNase I热灭活,不会影响到RNA本身。DNA-free DNase Treatment & Removal Reagent也包含在RNAqueous®-4PCR Kit中提供(参见上文“用于RT-PCR的RNA提取”)。