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RNA样本收集和保护

RNAlater溶液是一种水溶性组织储存试剂,可在完整、未冻存组织样品中保护细胞RNA。使用RNAlater溶液后不再需要立即处理组织样本,也无需将样本在液氮中冷冻待后续处理。点击此处查看关于RNAlater溶液的更多信息。

RNAlater溶液经过各种哺乳动物组织、植物、大肠杆菌、非洲爪蟾、鱼和果蝇的测试,已成功应用于我们所有的Ambion RNA分离试剂盒(见下图),包括RNAqueous总RNA分离试剂盒、ToTALLY RNA™总RNA分离试剂盒、RNAwiz™试剂和Poly(A)Purist™试剂盒及分子研究中心(Molecular Research Center)的TRI Reagent产品。其它商用RNA分离试剂盒和标准RNA分离实验方案也可与RNAlater溶液配合使用。

将组织切成任一方向小于0.5 cm的薄片,并浸没于约5倍体积的RNAlater溶液中(如0.5 g样本需要约2.5 mL的RNAlater溶液)。小的器官,如大鼠肾、肝和脾,可整个保存在RNAlater溶液中。细胞样品可以在少量PBS中重悬细胞沉淀,然后加入5-10体积的RNAlater溶液。样品在4°C下可保存1个月,25°C下可保存1周,-20°C下可无限期保存。您可将使用RNAlater溶液处理的组织保存在-20°C下作为存档。

用于RNA提取时,只需将组织从RNAlater溶液中取出,将其作为刚收集的组织进行处理。大多数组织可在裂解缓冲液中直接匀浆处理,但较硬的组织(如骨骼)则需要在液氮中冷冻后再研磨。

对于组织样本,我们推荐将组织在4°C下于过量的RNAlater溶液中孵育过夜后取出,使用灭菌的Kimwipe纸擦干,再进行裂解。

对于细胞样本,首先将细胞离心,倒出多余的RNAlater上清液。如果可能,应从细胞沉淀中吸出RNAlater溶液,然后再裂解。在RNAlater溶液中储存过的细胞通常更强韧,使用更高转速离心(5,000 x g)不会导致细胞裂解。

从在RNAlater溶液中储存过的组织中可以提取出DNA。请点击此处查看实验方案。蛋白质可以在RNAlater溶液中保留;但是,该溶液会使蛋白质变性。因此,从在RNAlater溶液中储存过的组织中提取出的蛋白质仍然适用于免疫印迹法或2D凝胶电泳等应用,但不适用于需要非变性蛋白质的应用。

通过对储存2年以上的RNA进行评估,已证明在RNAlater溶液中储存不会带来系统性偏差。想要了解更多信息,敬请查看我们的网页

虽然我们尚未对此进行检测,但以下参考文献认为使用RNAlater溶液处理不会使病毒灭活:

RNAlater溶液是抑菌剂。虽然细菌在RNAlater溶液中不会生长,但细胞仍保持完整。将大肠杆菌细胞储存在RNAlater溶液中,在4°C下保存1个月,细胞可保持完整,提取的RNA未降解。

可以,RNAlater溶液已被用于表皮葡萄球菌分离株。下面这篇文献描述了研究人员如何将该溶液用于革兰氏阳性菌:
Handke LD, Conlon KM, Slater SR et al. (2004) Genetic and phenotypic analysis of biofilm phenotypic variation in multiple Staphylococcus epidermidis isolates. J Med Microbiol 53(Pt5):367–344.

不能,RNAlater溶液中的组织必须在4°C保存过夜。

可以,使用RNAlater溶液处理后的细胞可通过荧光激活细胞分选法(FACS)进行分析。如果RNAlater溶液的粘性带来问题,则可能需要使用无核酸酶的冷水将其稀释。这不会影响对RNA的保护作用。应尽可能快速并在低温下处理样品。点击此处,阅读关于这一步的更多信息和文献。使用RNAlater溶液处理后的样品也可进行质谱分析。请注意,在去吸附/离子化步骤中,盐可在蛋白质上形成加合物。为避免出现这个问题,可透析样品以除去所有的盐。

RNA储存在RNAlater溶液中时,在37°C下可保存1天,25°C下可保存1周,4°C下可保存1个月,在-20°C下可长期保存。

尽管我们尚未对此进行检测,但有证据显示可以将保存于RNAlater溶液中的组织用于激光捕获显微切割。详见以下文献:
Thelen P, Burfeind P, Grzmil M et al. (2004) cDNA microarray analysis with amplified RNA after isolation of intact cellular RNA from neoplastic and non-neoplastic prostate tissue separated by laser microdissections. Int J Oncol 24(5):1085–1092.

我们不推荐这样做,因为RNAlater溶液本身是1X浓度。

可使用RNAlater-ICE冻存组织转变溶液浸泡冻存组织,并在–20°C或更低温度解冻过夜。解冻后,可作为新鲜组织进行标准RNA分离处理。

核酸酶

核酸酶

来源

剪切特异性

所需辅助因子

备注

RNase A

单链中C和U的3’端

用0.1% SDS灭活

RNase I

大肠杆菌(重组)

RNA单链中NTP的3’端

活性占大肠杆菌提取物中EDTA耐受RNase活性的98%

RNase T1

米曲菌(重组)

单链中G的3’末端

对G的特异性比A强10^6倍

RNase V1

眼镜蛇毒

dsRNA

Na+ (100 mM); Mg2+ (0.3 mM)

对ssRNA的剪切速度是dsRNA的10%

RNase H

大肠杆菌(重组)

RNA:DNA杂交体的RNA,形成以5’-磷酸为末端的寡核苷酸

Mg2+ (2–4 mM)

EDTA可去除酶活性,但酶仍可与RNA:DNA杂交体结合。RNase H不会降解DNA或未杂交的RNA。

应使用RNAse A或RNase T1消化总RNA。两者的混合物可用于核糖核酸酶保护实验。

镁和钙是DNase I所需的辅助因子。DNase I不会消化ssDNA。想要了解关于DNase I的更多信息,请点击此处

以下方法可去除DNase:酸性苯酚:氯仿抽提、氯化锂沉淀、EDTA和热灭活,或使用我们的MegaClear™ 转录回收试剂盒(货号AM1908)。

此外,我们的Ambion TURBO DNA-free™试剂盒(货号AM1907)包含DNase灭活试剂,可用于去除DNase以及镁和钙等二价阳离子,这些物质在RNA随样品一起加热时可催化RNA降解。

可以,虽然单次DNase处理通常可以满足绝大部分DNA去除需求,但也可以选择进行二次处理。请点击此处,查看实验方案。

RNA Isolation - General

可以提供。请访问此处,查看从人类组织以及大肠杆菌和人类细胞株中分离的FirstChoice总RNA。

可使用以下3种盐:

  • 硫氰酸胍,需要乙醇。硫氰酸胍是分离RNA的常用试剂,我们特别推荐将其用于核糖核酸酶活性较高的组织,如胰腺或脾脏。
  • 醋酸铵,需要乙醇。醋酸铵可用于减少不必要的dNTPs和寡糖共沉淀。但是,纯化的核酸如果后续要使用T4多核苷酸激酶处理的话,不能使用醋酸铵,因为铵离子会抑制T4多核苷酸激酶。
  • 氯化锂,不需要乙醇。LiCl能有效沉淀RNA而不能有效沉淀蛋白质或DNA,而且也不会沉淀未掺入的游离核苷酸。

RNA和DNA的最大吸收波长是260nm,而蛋白质的最大吸收波长在280nm。紫外/可见分光光度计会给出RNA/DNA吸光度比值,指示样品的纯度。RNA的A260/A280比值应约为2.0。如果该比值过低,则表示样品存在蛋白或酚的污染。A260/A230值可评价核酸纯度,预期范围为2.0-2.2。如果比值过低,则样品中存在污染物(通常为苯酚、胍类,乙醇或甘油等)。

28S和18S条带指示RNA的完整性。在一块凝胶上,28S和18S条带的比值应约为2:1。

紫外分光光度计是检测RNA浓度和纯度的传统方法。Agilent 2100 Bioanalyer仪器结合使用了微流体、毛细管电泳以及与核酸结合的荧光染料,可评估RNA浓度和完整性。点击此处,阅读关于以上2种方法的更多信息。

对于细菌样品,您可使用我们的TRIzol Max™细菌RNA分离试剂盒(货号16096040),该试剂盒在匀浆时含有额外的试剂,有助于细菌细胞壁的裂解。您也可以使用我们的PureLinkRNA小量提取试剂盒(货号12183018A),使用该试剂盒时,需要准备溶菌酶溶液以溶解细胞壁。

有,您可使用TRIzol试剂或mirVana™ PARIS™ RNA和非变性蛋白质纯化试剂盒。

请访问我们的网站,查看处理血液样品的技巧。

请参考特殊RNA分离(mRNA、miRNA和病毒RNA)和自动化RNA分离支持中心

RNA分离试剂盒

核酸的吸光度取决于介质的离子强度和pH。请查看以下按稀释剂进行分类的吸光值范围。

稀释剂

A260

A280

A260/A280

RNA (µg/mL)

细胞质RNA溶于蒸馏水

0.381

0.223

1.711

15.24

细胞质RNA溶于TE缓冲液

0.335

0.145

2.310

13.4

使用TRIzol试剂分离的RNA溶于蒸馏水

0.585

0.328

1.785

23.4

使用TRIzol试剂分离的RNA溶于TE缓冲液

0.544

0.247

2.206

21.76

尽管高A260/A280比值可能并不代表核酸样品非常纯,但低A260/A280比值(RNA为1.7)确实代表样品存在污染并且可能不适合某些应用。

您可使用玻璃、Teflon或强力匀浆器(Polytron或Tekmar’s Tissumizer匀浆器)来匀浆样品。培养的细胞不需要匀浆,只需要使用TRIzol试剂充分混匀。用TRIzol试剂裂解细胞时也可用超声处理。对于少量样品,可以尝试使用杜恩斯匀浆器(Dounce homogenizer)。

使用TRIzol试剂提取RNA时有若干潜在停止点和推荐保存条件:

  • 样品匀浆步骤:匀浆后(加入氯仿前),样品可在–70°C保存至少1年。匀浆后样品在加入氯仿前,可在室温保存数小时。
  • 样品匀浆步骤:如果样品已在TRIzol试剂中有效裂解且试剂已使核酸酶失活,RNA可在室温下安全保存3-4天。
  • RNA沉淀步骤:异丙醇中的RNA可在4°C保存过夜。在这种低温条件下延长保存时间不会明显影响RNA产量。不要保存在-20°C下,因为盐会沉淀;不要长期保存在室温中,因为异硫氰酸胍会损害RNA。
  • RNA洗涤步骤:75%乙醇中的RNA在4°C可保存1周,在–20°C可保存1年。


小体积(0.5-0.8 mL)TRIzol试剂已成功用于102-105个细胞。但是,如果使用小体积,我们推荐使用小离心管,从而尽可能获得较高的水相柱。液体柱越高,样品被中间相污染的可能性就越小。
以下是从少量组织(1–10 mg)或细胞(100–10,000)中分离RNA的实验方案:

  1. 向样品中加800 μL TRIzol试剂。用移液器反复吹打以混匀细胞。直接向TRIzol试剂中加入200 μg糖原(货号10814010)。处理组织时,首先在液氮中粉碎组织,然后加入含200 μg糖原(终浓度250ug/ml)的800 μL TRIzol试剂,随后用力涡旋振荡或强力匀浆。
  2. 在室温下,盖上管帽并高速涡旋10秒。确保TRIzol试剂使试管边缘湿润,使所有可能残留在管壁的样品溶解。
  3. 剪切基因组DNA时,将样品通过连接1 mL注射器的26-gauge针两次。使用注射器将样品转移到灭菌的1.5 mL微量离心管中。
  4. 向每个样品中加入160 μL氯仿(或比例为49:1的氯仿:异戊醇),涡旋振荡最多30秒。将微量离心管以最大速度离心5分钟,实现液相分离。
  5. 将上层水相转移到新离心管中,并加入400 μL预冷的异丙醇。将样品置于–20°C沉淀1小时至过夜。将微量离心管在室温以最大速度离心15分钟,使RNA沉淀。
  6. 倒出上清液。使用200 μL的70%乙醇洗涤沉淀,并再次以最大速度离心10分钟。倒出上清液,在不破坏沉淀的情况下尽量移除上清液。干燥RNA沉淀。
  7. 使用30–50 μL无RNase的去离子水重新溶解沉淀。如果是RNase含量较高的组织(如肾上腺、胰腺),则使用100%去离子甲酰胺重悬。确保进行涡旋振荡并使用移液器反复吹打,使沉淀完全溶解。保存于–70°C。

我们推荐使用纯氯仿。不需要异戊醇(尽管也可以使用比例为49:1的氯仿:异戊醇)。也可以使用含50 ppm戊烯的氯仿。此外,BCP(1-溴-2-氯丙烷)可取代氯仿。

TRIzol LS试剂专用于液体样品,如血清或病毒制品,而TRIzol 试剂专用于组织或细胞,包括富含脂质的样品和难提取样品。

TRIzol Plus RNA纯化试剂盒结合了TRIzol试剂的裂解能力和PureLink RNA小量提取试剂盒硅胶离心柱方便的RNA提取技术。点击此处了解关于系统的更多信息,或点击此处查看工作流程图解。

PureLink RNA小量提取试剂盒仅经过验证能够回收> 200 nt的RNA。但是,您可尝试以下改进方法,从而分离包括小RNA在内的总RNA:

  • 在纯化柱上样之前,向裂解物中加入更多乙醇。乙醇终浓度应至少为55%。
  • 将洗液1的乙醇浓度增加至最低55%。
  • 不用柱上DNase处理以减少对小RNA的损失。

可使用PureLink DNase(货号12185010)进行柱上消化。请查看手册附录第63页的实验方案。

我们的网站 中有图表对比了上述试剂盒在纯度检测和RNA完整指数(RIN)方面的差异。

PureLink RNA小量提取试剂盒提供快速的总RNA柱纯化,无需有机溶解(苯酚/氯仿)。单次提取可获得多达1,000 µg的纯化RNA。RiboPure™ RNA纯化试剂盒结合了苯酚/硫氰酸胍溶液和玻璃纤维过滤纯化法。

柱分离临界尺寸为200 nt。RiboPure™试剂盒不适用于回收miRNA。我们推荐使用mirVana™试剂盒、TRIzol Plus RNA纯化试剂盒或PureLink RNA微量提取试剂盒分离miRNA。

RNaqueous试剂盒是基于快速的过滤法RNA分离系统,不需要苯酚、氯仿或其他有毒有机试剂。RNAqueous总RNA分离试剂盒专用于10–75 mg的组织或106-107的细胞样品,而经过优化的RNAqueous-Midi总RNA分离试剂盒是用来从多至0.5g组织或109个细胞样品中提取总RNA的试剂盒。RNAqueous-Micro微量总RNA提取试剂盒可用于从微量样本中纯化总RNA,如10–500,000个培养细胞、少至10个显微切割细胞或最多10 mg的组织。RNAqueous-96总RNA分离试剂盒利用96孔板格式,对100至2 x 106个细胞或0.1至1.5 mg组织进行高通量RNA分离。RNAqueous-4PCR总RNA分离试剂盒专用于从少量组织样品(0.5–75 mg)以及少量至中量培养细胞样品(约100–107个细胞)中分离RNA。

不兼容,请遵循Tempus系统的RNA分离方法。Tempus收集管与RiboPure™试剂盒不兼容。

成分是0.1 mM EDTA溶于无核酸酶的水。

前者(货号AM1928)用于从人类血液中分离RNA,后者(货号AM1951)用于从小鼠和大鼠血液中分离RNA。两种试剂盒就有相同的纯化柱,但洗涤缓冲液1、洗涤缓冲液2/3和醋酸钠溶液不同。我们不推荐将小鼠试剂盒用于人类血液样品。小鼠试剂盒可适应和人类血液不同的小鼠/大鼠血液粘稠度,以及能获得较高的小鼠和大鼠血液RNA产量。根据小鼠试剂盒使用手册中的不同实验方案,可回收含有小RNA的总RNA或不含小RNA的总RNA。使用RiboPure™ 血液纯化试剂盒使用手册中的标准实验方案时,可分离不含小RNA的总RNA,而使用另一种替代方案时,可分离含小RNA的总RNA。此外,若只想得到小RNA,则应先采用上述替代方案得到含小RNA的总RNA,然后遵循mirVana miRNA分离试剂盒使用手册中的IVA部分(货号AM1560)。

从未预先分离的全血中提取的mRNA样品通常含有网织红细胞来源的的α和β-球蛋白mRNA,使用LeukoLOCK™总RNA分离系统提取的RNA中通常含有少于10%的此类mRNA。分离的RNA特别适用于基因表达谱分析,因为它含有更低比例的球蛋白mRNA。我们的LeukoLOCK™组分分离和稳定试剂盒(货号AM1933),可用于血液收集和稳定。之后客户可以使用LeukoLOCK™总RNA分离试剂盒(货号AM1934)可分离在LeukoLOCK™过滤器上稳定的RNA。在LeukoLOCK™总RNA分离系统(货号AM1923)试剂盒中同时包含AM1934和AM1933两个产品,可一起使用。

10 mL血液的RNA产量通常为10–20 µg。RNA质量取决于血液质量。一般来说,RNA完整指数(RIN)约为9,28S/18S比值约为1.5。

不能。尚未验证将该试剂盒用于少于3 mL的人类血液。最好使用9–10 mL血液。

LeukoLOCK™总RNA分离系统仅经过人类血液的测试。

不兼容,它们是基于不同的化学反应。

我们使用LeukoLOCK™总RNA分离系统处理过用肝素保存的血液。RNA看起来没有问题。但是,我们尚未测试将其用于任何下游应用。众所周知,肝素可以抑制RT-PCR等下游应用,所以我们不建议您使用肝素。

此处有单独提供的用于DNA/RNA纯化的可替换的缓冲液清单。

Cells-to-CT™试剂盒

可以,使用我们的Cells-to-CT™试剂盒可以省去RNA纯化步骤。点击此处,可阅读更多内容。

请访问此网页,查看已经测试过的细胞系。Cells-to-CT™系统应该能适用于所有细胞系。但是,由于细胞大小和成分的差异,每个裂解反应的最大细胞数在不同细胞系中会有轻微差异。您可使用TaqMan对照试剂盒检测抑制和最小样品起始量。

我们已经测试了将试剂反复冻融5-10次,发现对CT值无影响。裂解样品冻融多达5次,对基因表达数据无任何显著影响。

在使用Snigle Cell-to-CT试剂盒时,由于单个细胞个体差异以及转录差异的存在,我们不建议使用内参对数据进行归一化处理。由于存在这种差异,归一化反而会人为增加计算出来的单个细胞基因表达水平和实际值的差异。

裂解后样品可在室温下保存最多30分钟,加入终止液后可放置多至2小时。您可将细胞裂解液、cDNA和预扩增样品冻存,待后续处理。

不需要,评估富含GC的基因时无特殊注意事项。

我们尚未将该试剂盒用于植物组织。处理植物样品时,我们建议使用以下任意一种标准匀浆方法:(1)机械化匀浆机,(2)不锈钢珠打磨,或(3)使用研钵和研杵在液氮中研磨组织。

可以。Cells-to-CT™试剂盒可兼容多重qRT-PCRAssay。如果检测大量靶标,我们推荐结合TaqMan Assay一起使用。

Cells-to-CT™技术的特色是在裂解培养细胞的同时,能够去除基因组DNA并保护RNA完整性。因此,如果您遵循实验方案中的裂解/DNase处理步骤,则无需担心qRT-PCR中存在基因组DNA污染。

可以,Cells-to-CT™试剂盒可以与TaqMan低密度芯片一起使用。

有,下图显示使用Power SYBR Green Cells-to-CT™试剂盒和快速SYBR Green Cells-to-CT™试剂盒与一种传统RNA纯化方法提取的RNA同时进行实时PCR分析。大量目标基因的实验结果表明两种试剂盒的检测结果和纯化的RNA结果相当。点击此处,阅读关于SYBR Green Cells-to-CT™试剂盒的更多信息。

不相同。但是SYBR Cells-to-CT™的逆转录酶可以与TaqMan预混液一起使用(反之则不可行)。

  1. 加入终止液后,裂解液需在室温下孵育2分钟后再进行后续反应。但是裂解液不能在室温存放超过20分钟。裂解液可以在冰上保存最多2小时,在-20度或者-80度保存不超过5个月。
  2. 反转录步骤:反转录体系配好后,将体系轻弹混匀,短暂离心将混合好的试剂收集到反应管的底部,反转录反应液可在冰上存放最多4小时。
  3. 反转录反应完成后,反转录产物可以保存在-20度。

TaqMan基因表达Cells-to-CT™试剂盒可容纳的细胞裂解液体积为逆转录酶反应总体积的45%。

尽管我们尚未进行测试,但以下文章将我们的试剂盒用于丙型肝炎病毒感染的细胞:
Triyatni M, Berger EA, Saunier B (2011) A new model to produce infectious hepatitis C virus without the replication requirement. PLoS Pathog 7(4)::e1001333.

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