Datos de las muestras de HCS y HCA

Detección de inmunoensayo de alto rendimiento habilitada con las nuevas plataformas CellInsight CX7 Pro

Comparación del inmunoensayo sin lavado FirePlex™-HT entre los instrumentos CellInsight CX7 y CX7 Pro. El ensayo FirePlex sin lavado optimizado para la detección de alto rendimiento se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante para detectar 5 y 10 analitos por pocillo. Se cuantificó una curva estándar de 10 puntos para analizar la reproducibilidad de analitos y las ventanas de rango dinámico. El ensayo resultante se midió con las plataformas CellInsight CX7 (imágenes izquierdas) o CX7 Pro (imágenes derechas) y se cuantificó mediante el software FirePlex Analysis Workbench. Solo el instrumento CX7 Pro (imágenes de la derecha) pudo superar el rango dinámico de 2,5 (15 bits) o 3,0 (16 bits) y menos del 15 por ciento de CV intra-placa. El intervalo dinámico y el rendimiento de reproducibilidad significativamente mejorados se deben a la óptica superior del instrumento CX7 Pro y a la capacidad de detección QE al 95 %. Este experimento fue validado por Abcam™ utilizando los modos de cámara sCMOS CX7 Pro de 15 y 16 bits para consideraciones de detección de HT.

Aplicación de inmunooncología: Imágenes de la muerte celular dependiente de anticuerpos en esferoides de cáncer de mama

Eliminación de células dependientes de anticuerpos en esferoides de cáncer de mama. Se etiquetaron las células NK humanas aisladas con el kit de células NK humanas intactas Dynabeads con colorante CellTracker Deep Red. Las células de cáncer de mama humanas (SKBR3) se cultivaron durante la noche en placas de 96 pocillos Nunclon Sphera para formar esferoides, se trataron con el anticuerpo anti-HER2 Trastuzumab y, a continuación, se pusieron a prueba con células NK durante 4 horas. Las células se tiñeron con reactivo para detección CellEvent Caspase-3/7 Green y Hoechst 33342 y se adquirieron imágenes en plataforma de detección de alto contenido CellInsight CX7 LZR Plataforma. Las imágenes son una proyección de intensidad máxima de varias secciones Z. El reactivo de detección CellEvent Caspase-3/7 Green se utilizó para estudiar la apoptosis mediada por anticuerpos y células NK en esferoides. CellTracker Deep Red se utilizó para rastrear células NK dentro del esferoide. Trastuzumab unido al HER2 en células SKBR3 amplifica la respuesta antitumoral de células NK mediante apoptosis celular dependiente de anticuerpos.

Aplicación de análisis y adquisición de imágenes de esferoides: Segmentación y cuantificación de la proliferación de EdU y el tamaño del esferoide

Segmentación y cuantificación de EdU y tamaño de esferoide mediante el sistema CellInsight CX7 LZR. Las células A549 se incluyeron en placas a una densidad de 5000 células por pocillo en una microplaca de 96 pocillos en U Nunclon Sphera y se incubaron durante 24 horas en una incubadora de CO2. Se añadió EdU a una concentración final de 10 µM y se incubaron durante 1 h. Los esferoides se lavaron después y se fijaron con formaldehído al 4 % y se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,25 %. Los esferoides se tiñeron para EdU con el kit de ensayo HCS Click-iT EdU Alexa Fluor 488 siguiendo el protocolo del kit. La placa se sometió a la adquisición de imágenes con un objetivo 4x utilizando el modo confocal en una plataforma de detección de alto contenido CellInsight CX7 LZR. La imagen es una proyección de intensidad máxima de 200 cortes Z ópticos de 1 micrómetro cada uno. La cuantificación se realizó con el software HCS Studio 2.0 mediante la bioaplicación Morphology Explorer. El esferoide se segmentó como un objeto y las células positivas de EdU se contaron como manchas dentro del esferoide. Mediante la bioaplicación Morphology Explorer, los esferoides se segmentaron como un objeto completo y las células positivas de EdU se segmentaron dentro del esferoide y se trazó el número de células.

Adquisición de imágenes confocales de esferoides en 3D en modo de células vivas para bioaplicaciones

Adquisición de imágenes confocales de esferoides en 3D en modo de células vivas. (A) Las células A549 se incluyeron en placas a una densidad de 5000/pocillo en una placa de fondo en U y se incubaron durante 48 h en una incubadora de CO2. Los esferoides vivos se etiquetaron para células vivas y muertas con el  kit de viabilidad/citotoxicidad LIVE/DEAD. La placa se sometió a adquisición de imágenes automáticamente con un objetivo de 10x utilizando el modo confocal en un instrumento de HCS CellInsight CX7 LZR. La imagen es una proyección de intensidad máxima de varias secciones Z. Se observaron células muertas teñidas en el núcleo esferoideo (rojo) y células vivas (verde) en la periferia de los esferoides. (B) Las células A549 se incluyeron en placas a una densidad de 5000/pocillo en una placa de fondo en U y se incubaron durante 24 horas en la incubadora de CO2. Los esferoides vivos se tiñeron con reactivo de detección MitoTracker Orange CMTMRos y CellEvent Caspase-3/7 Green Reagent durante 30 minutos. La placa se sometió a adquisición de imágenes automáticamente con un objetivo de 10x utilizando modo confocal en un instrumento de HCS CellInsight CX7 LZR. La imagen es una proyección de intensidad máxima de varias secciones Z. En los esferoides vivos A549, la mayoría de las células están sanas, según lo observado por la tinción MitoTracker Orange, y se observaron muy pocas células apoptóticas. (C) Las células A549 se incluyeron en placas a una densidad de 5000/pocillo en una placa de fondo en U y se incubaron durante 24 horas en una incubadora de CO2. Los esferoides vivos se tiñeron con el reactivo Image-iT Green Hypoxia durante 30 min. La placa se sometió a adquisición de imágenes automáticamente con un objetivo de 10x utilizando el modo confocal en un instrumento de HCS CellInsight CX7 LZR. La imagen es una proyección de intensidad máxima de varias secciones Z. Los esferoides A549 vivos muestran la tinción de hipoxia cuando se tiñen con el reactivo Image-iT Green Hypoxia. (D) Las células SKBR3 se incluyeron en placas a una densidad de 5000/pocillo en una placa de fondo en U y se incubaron durante 24 horas en una incubadora de CO2. Después, se incubaron esferoides vivos con el anticuerpo de Herceptin conjugado pHrodo Red durante 24 h. La placa se sometió a adquisición de imágenes automáticamente con un objetivo de 4x utilizando el modo confocal en un instrumento de HCS CellInsight CX7 LZR. La imagen es una proyección de intensidad máxima de varias secciones Z. El anticuerpo Herceptin conjugado pHrodo internalizado se observa en las vesículas intracelulares. (E) Las neuroesferas se diferenciaron de los neurocitoblastos (NSC) en Neurobasal Plus Medium con Culture One Supplement. Las neuroesferas vivas se tiñeron con Tubulin Tracker Deep Red durante 1 h. La placa se sometió a adquisición de imágenes automáticamente con un objetivo de 4x utilizando el modo confocal en un instrumento de HCS CellInsight CX7 LZR. La imagen es una proyección de intensidad máxima de varias secciones Z. Tubulina Tracker Deep Red tiñe las neuritas en las neuroesferas diferenciadas de NSC. (F) Las células HeLa se incluyeron en placas a una densidad de 5000/pocillo en una placa con fondo en U y se incubaron durante 24 horas en una incubadora de CO2. Los linfocitos T activados se marcaron con CellTracker Deep Red y se añadieron unas 5000 células a cada pocillo. Después de 2 h de incubación con linfocitos T activados, los esferoides se tiñeron con indicador de pH pHrodo Green AM Intracellular durante 30 min. Las células se lavaron 3 veces con PBS y se sometieron a adquisición de imágenes con el objetivo 4x utilizando el modo confocal en un instrumento de HCS CellInsight CX7 LZR. La imagen es una proyección de intensidad máxima de varias secciones Z. Aumento intracelular de la fluorescencia de pHrodo Green AM tras la adición de linfocitos T activados.

Adquisición de imágenes y análisis de células proliferantes en esferoides

Análisis de células proliferantes en esferoides HeLa. Las células HeLa se incluyeron en placas a una densidad de 5000/pocillo en una placa de fondo en U Nunclon Sphera y se incubaron durante 24 horas en una incubadora de CO2. Los esferoides se trataron con 50 µM de hidroxiurea durante 24 h. Los esferoides se pulsaron con 10 µM de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) durante 30 minutos. Los esferoides se lavaron con PBS y se tiñeron para células proliferantes mediante el ensayo de HCS Click-iT EdU Alexa Fluor 488. Los esferoides se lavaron y tiñeron con un anticuerpo Ki67 conjugado con el colorante Alexa Fluor 647. Los esferoides se sometieron a adquisición de imágenes automáticamente con un objetivo de 10x utilizando el modo confocal en un instrumento de HCS CellInsight CX7 LZR. La imagen es una proyección de intensidad máxima de varias secciones Z. Los esferoides se segmentaron como un objeto y las células positivas EdU y Ki67 se cuantificaron como puntos dentro del esferoide. Se observaron tanto células positivas de EdU como de Ki67 en esferoides de control. En esferoides tratados con hidroxiurea, desaparecieron las células de fase S proliferantes (EdU negativo) y solo se observaron células Ki67 positivas.

Aplicación de inmunooncología: Adquisición de imágenes de la penetración de linfocitos T y eliminación de esferoides de cáncer de pulmón

Penetración de linfocitos T y eliminación de esferoides de cáncer de pulmón. Los esferoides se formaron mediante la siembra de células A549 utilizando el medio esencial mínimo (MEM) Gibco en placas de fondo en U Nunclon Sphera y el cultivo durante 2 días. Los linfocitos T aislados de PBMC humanos con Dynabeads Human T-Expander CD3/CD28 se activaron durante 72 h y se marcaron con el colorante CellTracker Deep Red antes de añadirse a esferoides de cáncer de pulmón durante 4 h. Las células se marcaron con el reactivo CellEvent Caspase 3/7. Se evaluó la penetración de linfocitos T y la citotoxicidad tumoral mediante la adquisición de imágenes de esferoides completos de células vivas en la plataforma de alto contenido CellInsight CX7 LZR. Los linfocitos T activados penetraron los esferoides (rojos) e indujeron la apoptosis en las células diana a través de los esferoides, como se observa mediante una mayor tinción con el reactivo CellEvent Caspase 3/7 (verde).