신호 증폭을 사용한 멀티플렉스 조직 염색

이 프로토콜은 조직 샘플에서 표적 분자를 검출 및 시각화하기 위해 Invitrogen SuperBoost 또는 Aluora Spatial Spatial Amplification kit를 사용하든 상관없이 따를 수 있습니다. 이 프로토콜은 슬라이드 상의 라벨링 되지 않은 FFPE 조직 샘플로부터 시작하여 형광 염료로 라벨링된 여러 개의 표적을 포함하는 다중 컬러 조직 샘플을 만듭니다. 그런 다음, 라벨링된 조직은 Invitrogen EVOS M7000 Imaging System 및 CellInsight CX7 기기를 포함한 다양한 형광 현미경 또는 Akoya PhenoImager 및 EVOS S1000 시스템과 같은 공간 이미징 시스템에서 공간 이미징을 위한 준비가 됩니다. 멀티플렉싱 중 편의성과 효율성을 높이기 위해 Leica Bond RX 시스템과 같은 자동 슬라이드 염색기를 사용하여 이러한 단계를 수행할 수 있습니다.

• 조직 샘플이 마르도록 두지 마세요. 마른 조직은 신호가 잘못되거나 나타나지 않습니다. 인큐베이션 및 세척 단계 동안 조직을 완전히 덮을 수 있는 충분한 용액이 있는지 확인하세요. 가습 챔버(예: 젖은 종이 타월이 있는 덮힌 상자)를 사용하는 것을 추천합니다.
• 선명한 염색 결과를 얻으려면 일차 항체 희석을 최적화해야 합니다.
• Alexa Fluor tyramide 또는 Aluora 시약을 사용한 라벨링 단계의 최적화는 배경에 대비한 신호를 향상시키는 고해상도 이미지를 얻는 데 매우 중요합니다.
• 멀티플렉싱 fluorophore의 경우, 샘플을 위해 heat-induced epitope (항원) retrieval (HIER) 절차를 최적화할 수 있습니다.
• 사용 당일 시약을 준비합니다.

참고: Tyramide SuperBoost 키트는 150개 슬라이드 또는 50개 슬라이드를 포함하는 두 가지 사이즈로 제공되며, HRP에 결합된 이차 항체가 있거나 없는 상태로 제공됩니다. Aluora Spatial Amplification 키트는 100개의 슬라이드 키트로 제공됩니다.

가습 챔버를 구축하여 샘플이 건조되지 않도록 합니다.

1. 종이 타월을 증류수로 젖게 합니다.
2. 슬라이드 용기를 젖은 종이 타월로 덮습니다.
3. 젖은 종이 타월 위에 파라필름을 덮습니다.

키트를 사용하기 전에 일차 항체를 최적화하는 것을 추천드립니다. 양성 및 음성 대조물질 슬라이드는 1:100, 1:500, 1:1000, 1:5,000, 1:10,000 등을 포함한 연속 희석으로 염색해야 합니다.

많은 멀티플렉스 실험에서 이차 항체 염색 및 티라미드 기반 반응 조건을 모든 항체에 대해 동일하게 유지하면서 일차 항체 농도를 최적화할 수 있습니다.

Alexa Fluor tyramide 또는 Aluora dye의 작용을 위한 인큐베이션 기간은 특정 신호를 가진 고해상도 이미지를 얻는 데 매우 중요합니다. 이 실험을 처음 수행할 때 다양한 인큐베이션 시간 지점에서 양성 및 음성 대조 슬라이드를 사용하여 인큐베이션 기간을 최적화할 것을 매우 권장합니다.

이 단계의 인큐베이션 시간을 최적화하려면 양성 및 음성 대조 슬라이드를 사용하여 0, 2, 5, 7 및 10분 인큐베이션을 수행합니다.

• 음성 대조에서 비특이적 신호가 있거나 양성 대조에서 신호가 흐릿한 경우에는 인큐베이션 시간을 줄이세요.
• 양성 대조에서 신호가 희미하거나 없다면, 인큐베이션 시간을 증가시키세요.

대조 슬라이드

• 일차 음성 대조 없음 (일차 항체 생략)
• 일차 및 이차 음성 대조 없음 (일차 및 이차 항체 생략)

2. 표준 항원 회수 프로토콜에 따라 전자렌지 또는 압력솥을 사용하여 시트르산 버퍼 (pH 6.0) 또는 EDTA (pH 9) 중 하나를 사용하여 heat-induced epitope retrieval(HIER)를 실시합니다.
참고: 자동 슬라이드 염색기를 왁스 제거/파라핀 제거 및 HIER 단계에 사용할 수 있습니다.

(선택 사항) 라벨링 전에 백색광을 사용하여 자가형광 감소를 수행합니다(Nat Cancer 2023 Jul;4(7):1036-1052에서 설명된 방법).

3. 샘플을 실온에서 1X PBS로 헹굽니다.

4. 자가형광 작업 용액(PBS 중의 4.5% 과산화수소 및 24 mM NaOH)으로 덮인 투명한 용기에 슬라이드를 넣습니다.

5. 60분 동안 백색광을 비춥니다.
참고: 자외선 조명은 특정 항원을 파괴할 수 있으므로 사용하지 않는 것이 좋습니다.

(선택 사항) Image-iT FX Signal Enhancer를 사용하여 비특이적 염료 결합을 줄입니다.

6. 샘플을 실온에서 1X PBS로 헹굽니다.

7. 4방울 또는 200 μL의 Image-iT FX Signal Enhancer를 적용하여 각 커버슬립 또는 부위를 덮습니다.

8. 습한 환경의 실온에서 30분 동안 인큐베이션합니다.

9. 샘플을 실온에서 1X PBS로 헹굽니다.

이 단계를 시작하기 전에 모든 시약을 준비하세요.

샘플에서 내인성 과산화효소 비활성화

1. 3% 과산화수소 용액으로 샘플을 덮습니다.

2. 습한 환경의 실온에서 60분 동안 인큐베이션합니다.

3. 샘플을 실온에서 1X PBS로 헹굽니다.

(선택 사항) HRP-콘주게이트된 스트레타비딘 이차 항체를 사용하는 경우 샘플에서 내인성 비오틴을 차단합니다. Invitrogen Endogenous Biotin-Blocking Kit (카탈로그 번호 E21390)의 사용을 추천합니다.

4. 세포 또는 조직에 스트렙타비딘 시약 한 두 방울을 도포하고 습한 환경에서 실온에서 15–30분 동안 인큐베이션합니다.

5. 샘플을 실온에서 1X PBS로 헹굽니다.

6. 비오틴 시약 한 두 방울을 추가하고 습한 환경에서 실온에서 15–30분 동안 인큐베이션합니다.

7. 샘플을 실온에서 1X PBS로 헹굽니다.

비특이적 결합을 위한 샘플 블로킹

8. 차단 버퍼 2–3방울(약 100–150 µL)을 샘플에 추가합니다.

9. 습한 환경의 실온에서 60분 동안 인큐베이션합니다.

참고: 자동 슬라이드 염색기를 사용하여 멀티플렉싱하는 경우, 항-마우스 및 항-토끼 poly-HRP-콘주게이트 이차 항체를 단일 염색 용액에서 1:1로 결합할 수 있습니다. 이렇게 하면 절차를 단순화하여 마우스 또는 토끼 일차 항체로 염색할 때 동일한 이차 항체 염색 용액을 사용할 수 있습니다.

1. 마우스 또는 토끼를 숙주로 사용한 일차 항체로 조직을 라벨링합니다. 차단 버퍼에서 항체를 희석합니다.
   참고: 일차 항체 염색 농도를 최적화할 것을 권장합니다.
2. 조직을 실온에서 30-60분 동안 또는 습한 환경의 2-8°C 에서 하룻밤 동안 인큐베이션합니다.
   중요: 스트렙타비딘이 있는 키트를 사용하는 경우, 비오틴 콘주게이트된 일차 항체를 사용합니다.
3. 로커(rocker) 상, 실온에서 1X PBS로 2분 동안 조직을 세척합니다. 이 단계를 세 번 반복합니다.
4. 비표지 일차 항체를 위한 poly-HRP-콘주게이트된 이차 항체 2–3방울 또는 바이오티닐화된 일차 항체를 위한 HRP-콘주게이트된 스트렙타비딘을 조직에 추가합니다.
5. 실온에서 10-60분 동안 또는 습한 환경의 2-8°C에서 하룻밤 동안 인큐베이션합니다.
   참고: 비특이적 신호를 관찰할 경우, 이 인큐베이션 기간을 단축할 수 있습니다.
6. 습한 환경의 로커(rocker) 상, 실온에서 1X PBS로 조직을 2분 동안 세척합니다. 이 단계를 세 번 반복합니다.

이 단계를 시작하기 전에 모든 시약을 준비하세요.

Alexa Fluor tyramide 또는 Aluora dye 작업 용액과 반응 중지 시약 인큐베이션 기간 둘다를 최적화한 후 진행시킵니다.

Alexa Fluor tyramide 또는 Aluora dye로 라벨링

1. Alexa Fluor tyramide 또는 Aluora dye 작업 용액 100 μL를 조직에 추가합니다.
2. 습한 환경의 실온에서 최적화된 시간(2–10분)에 따라 인큐베이션합니다.
   (1) 반응 중지 시약을 사용하거나 (2) HIER을 실행하여 항체를 제거하여 반응을 중지시킬 수 있습니다. 일차 항체로 멀티플렉싱하는 경우 HIER을 사용하는 것을 권장합니다.
   
   중지 시약 사용. 단일 반응에 권장됨
   
   
3. 100 µL 의 반응 중지 시약 작업 용액을 추가합니다.
4. 실온에서 1X PBS로 조직을 세 번 헹굽니다.
5. Biotin-XX만 포함된 키트: 비오틴-XX가 포함된 키트를 사용하는 경우, 콘주게이트된 스트렙타비딘을 사용하세요. 아래의 "비오틴-XX의 검출에 권장되는 스트렙타비딘 콘주게이트(Streptavidin Conjugate)" 표를 참조하세요.
   참고:형광 스트렙타비딘과 함께 비오틴-XX를 사용하는 경우, 스트렙타비딘으로 라벨링 후 HIER을 수행하지 마십시오. 그러면 형광 스트렙타비딘도 제거됩니다.

항체 제거/스트리핑 수행(HIER 사용). 동일하거나 다른 종의 일차 항체로 멀티플렉싱할 때 권장됨.

FFPE 조직 샘플에 대한 멀티플렉싱의 경우, SuperBoost 및 Aluora 공간 증폭 키트는 Tóth 및 Mezey (J Histochem Cytochem, 2007)에서 설명한 시트르산 버퍼/마이크로파 방법과 호환되어, 샘플에서 일차 및 이차 항체를 제거하고 과산화효소 활성을 제거합니다. 이 방법은 공유 결합 부착된 fluorophore의 형광에 큰 영향을 주지 않으며, 동일하거나 다른 종의 추가 일차 항체로 조직을 다시 프로브한 후 SuperBoost 또는 Aluora 신호 증폭을 수행할 수 있습니다.

1. 시트르산 버퍼 (pH 6.0), 농축(카탈로그 번호 005000)를 증류수 내에서 1:20로 희석합니다.
2. 위의 "Alexa Fluor tyramide 또는 Aluora dye로 라벨링" 단계를 완료한 후, 희석된 시트르산 버퍼(pH 6.0)에 조직을 넣고, 끓을 때까지 100% 전력으로 전자레인지에서 가열합니다(1–2.5분).
3. 전력을 20%로 줄이고 추가 15분 동안 마이크로파를 계속 유지합니다.
4. 조직 샘플을 시트르산 버퍼 내에 유지시키면서 실온으로 냉각시킵니다.
5. 1X PBS로 샘플을 두 번 세척합니다.
6. 다음의 동일하거나 다른 숙주 종의 일차 항체를 사용하여 상기의 "비특이적 결합을 위한 샘플 블로킹"부터 시작하는 단계들을 반복합니다. 추가적인 표적을 위해 필요한 만큼 이 단계들을 반복합니다.

대비 염색 및 검출

1. 표준 프로토콜을 사용하여 필요에 따라 조직을 대비 염색합니다. 핵 대비 염색에 권장되는 일부 시약은 다음과 같습니다.

대비 염색 시약

2. 광퇴색 방지 속성이 있는 봉입제를 사용하여 커버슬립을 장착합니다.

• ProLong Glass Antifade Mountant (카탈로그 번호 P36984)는 하드 세트 장착과 조직의 장기간 보관을 위해 권장됩니다.
• SlowFade Glass Soft-set Antifade Mountant (카탈로그 번호 S36917)는 조직 샘플에 커버슬립 제거가 필요한 경우에 소프트 세트 장착에 권장됩니다.
  최적의 결과를 얻으려면, 봉입제와 함께 제공되는 지침을 따르세요.

3. 호환되는 이미징 기기를 사용하여 조직을 분석합니다.

신호 증폭 프로토콜은 poly-HRP에 콘주게이트된 이차 항체를 사용하는 것을 권장하고 전체 키트로 제공됩니다. HRP에 콘주게이트된 이차 항체는 최적의 신호를 제공하지 않을 수도 있습니다.

Biotin-XX tyramide는 표에 나와 있는 것처럼 형광 스트랩타비딘을 사용해야 합니다.

Lin JR, Chen YA, Campton D, Cooper J, Coy S, Yapp C, Tefft JB, McCarty E, Ligon KL, Rodig SJ, Reese S, George T, Santagata S, Sorger PK. High-plex immunofluorescence imaging and traditional histology of the same tissue section for discovering image-based biomarkers. Nat Cancer. 2023 Jul;4(7):1036-1052. doi: 10.1038/s43018-023-00576-1. PMID: 37349501

PhenoImager는 Akoya Biosciences의 상표입니다. BOND는 Leica Biosystems 및 그 계열사의 상표입니다.