Fixed-Cell Imaging Reagents

改善固定细胞成像实验结果

为了让您从固定细胞成像实验中能获得尽可能丰富的结果,Invitrogen™ Molecular Probes™推出了经过优化实验流程的预混包装试剂盒,配合易用且功能强大的显微镜可使用事半功倍。您可通过下文看到用于细胞固定和透化、细胞标记、图像采集等的产品。

免费获取五步法细胞成像实验指南,轻松获得可供发表的高品质图像。

观看讲座“免疫荧光成像秘籍”

five-steps-thumb

免费下载《五步法高品质细胞成像指南》,轻松获得可供发表的高品质图像

马上下载

五步法高品质固定细胞成像

遵照如下5个步骤采集尽可能完美的固定细胞图像,即使您第一次使用也可获得可供发表的高品质细胞图像。

步骤一:细胞和组织样本处理

为实现最佳的图像质量,首先应建立针对目的蛋白和细胞结构的研究,同时将其他一切背景等排除在图像之外。固定和破膜细胞样本用于标记 – 首先将细胞结构、蛋白和核酸固定,然后使荧光染料和抗体渗入到细胞内部,标记目的靶点。封闭细胞样本,防止荧光标记物与研究无关的蛋白非特异性结合,最大限度提高信噪比。

Stained cell images, with and without optimized fixation

在固定和破膜之后,使用NucBlue活细胞染料及ActinGreen 488 ReadyProbes即用型试剂对U2OS细胞进行染色。图A采用传统甲醇溶液方法固定,图B则采用基于甲醛优化配方的Image-iT固定/透化试剂盒固定。对比可发现,图A中甲醇固定的方法可导致肌动蛋白细胞骨架断裂和细胞破碎,而Image-iT 固定/透化试剂盒则可为绝大多数细胞类型提供最佳固定条件。

产品 描述 货号
Image-iT固定/透化试剂盒
  • 固定:高纯度的4%福尔马林PBS溶液,pH 7.3
  • 透化液:0.5% Triton X-100
  • 封闭液:3% BSA,fraction V,脱脂,产自新西兰,DPBS溶液
  • 洗涤液:pH 7.4
R37602
BlockAid封闭液 50 mL B10710

五步法高品质固定细胞成像 - 1.1培养条件
获得高品质图像的第一步是样本制备。对于培养的细胞,细胞必须具有良好的健康状态和形态,以及恰好的融合度。健康的细胞即是获得优质数据的基础。

五步法高品质固定细胞成像 - 1.2固定
样本制备的下一步是固定。固定是指杀死细胞并保留其特定生理状态的化学方法,在多数情况下就是保护细胞形态。采用合适的固定方法才能保护靶点。

五步法高品质固定细胞成像 - 1.3透化
下一步是细胞透化,这是打开细胞内标记的关键步骤。

五步法高品质固定细胞成像 - 1.4封闭
透化的下一步是封闭。封闭方法有很多种,蛋白质封闭相当于特殊的抗体结合。染料电荷封闭即减少非特异性结合。

五步法高品质固定细胞成像 - 1.5自发荧光
细胞制备的最后一步是消除自发荧光。 细胞和组织具有一定程度的自发荧光,这可能会干扰特定信号并降低信噪比,消除自发荧光可提高灵敏度。

步骤二:标记样本

通过不同颜色荧光标记不同的靶标,可以直观的观察同一样本细胞内不同结构和蛋白。荧光标记靶标的方法主要包括荧光染料、免疫标记、荧光融合蛋白等——这几种方法均可选择性标记细胞内的结构和蛋白,让您在成像时更轻松地进行观察。细胞生物学采用的很多荧光工具基本上都是荧光基团。这些荧光基团经过不同的方法修饰或结合到不同的分子上,从而具备了某些的功能与特定的细胞器或蛋白结合。通过化学修饰,单个荧光基团可以产生许多变体形式,且每种变体都有不同的特异性。例如,发出绿色荧光的Invitrogen Alexa Fluor 488染料分子经过修饰后,可以靶向肌动蛋白微丝,可以结合IgG用于免疫标记,还可用作全细胞染料。Invitrogen提供了超过51000种高品质一抗,其中的部分抗体可以直接结合大量明亮的荧光染料和标记物,包括Invitrogen Alexa Fluor染料系列。访问 thermofisher.com/primaryantibodies了解我们丰富的荧光染料产品。

ActinGreen488 mitoSecAbAF750

采用Invitrogen Image-iT 固定/透化试剂盒制备染色用的培养细胞,然后采用Invitrogen BlockAid封闭液处理。先采用能识别线粒体的一抗标记样品,然后与Alexa Fluor 750 染料标记的二抗 (紫色),Invitrogen NucBlue细胞核染料(蓝色) 和Invitrogen ActinGreen 488即用型试剂(绿色)孵育。在Invitrogen EVOS FL全自动细胞成像系统上采集图像。

五步法高品质固定细胞成像 - 2.1一抗选择
样本制备完成后,获得出版级图像的第二步是标记样本,通常涉及到目标靶点的一抗。

五步法高品质固定细胞成像 - 2.2一抗方案优化
每个一抗都必须单独优化,有许多方案可供选择。不优化直接使用可能会导致很差的结果,因为每种抗体都略有不同,这一点非常重要。

步骤三:检测样本

检测复杂的生物学结构需要最高清晰度的荧光信号,并将荧光信号从背景噪声中分离开来。标准的免疫荧光标记很少能够获得最佳信噪比的成像效果。获得良好图片和极佳的可供发表的高质量图像之间的差异就在于:需要精细调整样品信号达到峰值特异性、高清晰度和最佳放大倍数。

轻松、快速选择所需的标记溶液

Lg superboost multiplex icc/ihc

固定和破膜HeLa细胞,采用Image-iT固定/透化试剂盒之中的试剂处理,与抗微管蛋白一抗及Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG (H+L) 二抗一同孵育。然后将细胞与抗ATP 合成酶亚型 IF1 抗体一同孵育,并采用Alexa Fluor 594 Tyramide SuperBoost 试剂盒(山羊抗小鼠IgG 和 Alexa Fluor 594酪胺)中的试剂进行标记。用NucBlue 可固定细胞即用型染料标记细胞核。采用共聚焦显微镜采集图像。

中等至高丰度的蛋白靶标

二抗可用于间接检测目的抗原。一抗与靶标直接结合,而二抗则以一抗为桥梁,间接结合目标生物分子。这种方法可以放大信号,提高灵敏度,最大限度的检测出靶标。
查找二抗

中等至低丰度的蛋白靶标

链霉亲和素结合物可以提高标记靶标的荧光基团的数量,从而放大信号。基于链霉亲和素信号放大技术广泛应用于荧光成像,用以提高一抗和二抗检测的灵敏度。
进一步了解链酶亲和素信号放大技术用于成像

低丰度蛋白靶标

对于传统方法无法检测到的低丰度蛋白靶标,酪胺信号放大技术(TSA)可以在不降低分辨率的前提下,进行灵敏的检测。TSA技术采用了一种能在过氧化氢存在的条件下释放活性染料的酶,从而使靶标明显且清晰的与背景区分开。
详细了解如何采用TSA技术对低丰度靶标成像

五步法高品质固定细胞成像 - 3.1二抗选择
获得出版级图像的第三步是检测标记。也就是使用二抗或信号放大技术等进行检测,并确定使用哪种对照。我们介绍了多种可选方案。

五步法高品质固定细胞成像 - 3.2二抗优化
二抗检测方案也需要针对所使用的每种一抗进行优化。

五步法高品质固定细胞成像 - 3.3信号放大技术
如果常规的二抗方案信号不够强,您可以采用信号放大技术来增强信号。这对于样品中的低表达抗原或稀有细胞检测尤为重要。

五步法高品质固定细胞成像 - 3.4对照
研究人员应设置所有必要的对照实验,以排除出现非特异性结合或非特异性信号的可能性。我们介绍了各种对照类型。适当的对照可以提高最终结果的可信度。

五步法高品质固定细胞成像 - 3.5染料选择和特殊注意事项
有许多不同染料可供选择,涵盖可见光、远红光和红外波长。以下所述注意事项有助于您在实验中做出最佳的选择。

步骤四:保护样本

虽然荧光基团是进行高质量细胞成像的最佳选择,但不可避免地也极易发生光漂白,即荧光信号的光化学降解或衰退。任何光敏感度的下降都可能导致数据出现偏差,产生假性结果。抗淬灭封片剂可以保护荧光标记蛋白的稳定性,维持数周乃至数月的图像信号完整度。

ProLong抗淬灭封片剂用于固定细胞成像具有以下好处:

  • 即使在长时间储存后,仍可以在整个光谱范围内抑制光漂白
  • 在整个光谱范围内的背景都很低
  • 固化封片剂
  • 可选含有或不含DAPI两种形式
  • 即用型随取随用优化配方
  • 可根据您的需求选择折射率:ProLong Glass试剂为1.52,ProLong Diamond和ProLong Gold试剂为1.47

了解更多用于固定细胞成像的Invitrogen ProLong抗淬灭剂

multipanel image series showing fluorescence stained cell following repeated illumination

60秒延时成像显示,使用ProLong抗淬灭封片剂能够提高对光漂白的抵抗性。使用FITC鬼笔环肽标记固定的HeLa细胞,并使用ProLong Glass试剂ProLong Diamond试剂ProLong Gold试剂或50% PBS/甘油封片。在使用标准100瓦汞弧灯连续照明的条件下,使用20倍物镜以12秒间隔采集图像。

推荐科学海报

抗淬灭封片剂有助于改善3D生物样本的成像质量。

下载海报

五步法高品质固定细胞成像 - 4.1封片剂
使用正确的封片剂将改善您的实验。请一定为您的成像选择合适的封片剂。

五步法高品质固定细胞成像 - 4.2光漂白和抗淬灭
什么是光漂白?如何防止光漂白破坏您的样品?为您介绍多种抗淬灭剂选择指南。

步骤五:样本成像

通过采集最高清晰度图像突破研究新发现。在当今激烈的科研竞争环境下,能否快速获得可供发表的高质量图像是决定您成败的关键。想要获取最顶级的图像,就需要配备顶级成像元件的成像平台,包括:

  • 高品质照机和光学元件,采集高分辨率图像
  • LED光立方,获得出众的信噪比
  • 简单易用的图像采集和处理软件,直接获得可供发表的图像

通过比较以下成像系统,找到最适合您的成像需求的一款产品。

点击此处获取更多关于细胞成像系统的信息

基本的倒置透射光数字系统 高级倒置透射光数字系统 基本的荧光系统 高级荧光系统 全自动活细胞荧光系统

EVOS XL Core
适用于细胞培养和常规细胞维持

EVOS XL
适用于更高级的比色分析

EVOS FLoid
适用于快速荧光图像展示

EVOS FL
适用于多通道荧光成像和转染


EVOS FL Auto 2
适用于各类高级、自动化应用领域

固定细胞成像试剂选择表

EVOS DAPI Light Cube (AMEP4650)
Excitation: 357/44 nm;
Emission: 447/60 nm
EVOS GFP Light Cube (AMEP4651)
Excitation: 470/22 nm;
Emission: 510/42 nm
Step Application Key tools for GFP channel
Step 1. Fix, permeabilize, and block Buffers
Step 2. Label Mitochondria
Cytoskeleton
Plasma membrane
Nucleus
Step 3. Detect Antibody direct labeling kits
Zenon kits
Secondary antibodies
Streptavidin
SuperBoost TSA kits
Step 4. Protect and enhance Signal enhancer
Mountants and antifades
Step 5. Image Imaging and analysis
EVOS RFP Light Cube (AMEP4652)
Excitation: 531/40 nm;
Emission: 593/40 nm
Step Application Key tools for RFP channel
Step 1. Fix, permeabilize, and block Buffers
Step 2. Label Mitochondria
Cytoskeleton
Plasma membrane
Nucleus
Step 3. Detect Antibody direct labeling kits
Zenon kits
Streptavidin
SuperBoost TSA kits
Step 4. Protect and enhance Signal enhancer
Mountants and antifades
Step 5. Image Imaging and analysis
EVOS Texas Red Light Cube (AMEP4655)
Excitation: 585/29 nm;
Emission: 624/40 nm
EVOS Cy5 Light Cube (AMEP4656)
Excitation: 628/40 nm;
Emission: 693/40 nm
Step Application Key tools for Cy5 channel
Step 1. Fix, permeabilize, and block Buffers
Step 2. Label Mitochondria
Cytoskeleton
Plasma membrane
Nucleus
Step 3. Detect Antibody direct labeling kits
Zenon kits
Streptavidin
SuperBoost TSA kits
Step 4. Protect and enhance Signal enhancer
Mountants and antifades
Step 5. Image Imaging and analysis
EVOS DAPI Light Cube (AMEP4650)
Excitation: 357/44 nm;
Emission: 447/60 nm
EVOS GFP Light Cube (AMEP4651)
Excitation: 470/22 nm;
Emission: 510/42 nm
Step Application Key tools for GFP channel
Step 1. Fix, permeabilize, and block Buffers
Step 2. Label Mitochondria
Cytoskeleton
Plasma membrane
Nucleus
Step 3. Detect Antibody direct labeling kits
Zenon kits
Secondary antibodies
Streptavidin
SuperBoost TSA kits
Step 4. Protect and enhance Signal enhancer
Mountants and antifades
Step 5. Image Imaging and analysis
EVOS RFP Light Cube (AMEP4652)
Excitation: 531/40 nm;
Emission: 593/40 nm
Step Application Key tools for RFP channel
Step 1. Fix, permeabilize, and block Buffers
Step 2. Label Mitochondria
Cytoskeleton
Plasma membrane
Nucleus
Step 3. Detect Antibody direct labeling kits
Zenon kits
Streptavidin
SuperBoost TSA kits
Step 4. Protect and enhance Signal enhancer
Mountants and antifades
Step 5. Image Imaging and analysis
EVOS Texas Red Light Cube (AMEP4655)
Excitation: 585/29 nm;
Emission: 624/40 nm
EVOS Cy5 Light Cube (AMEP4656)
Excitation: 628/40 nm;
Emission: 693/40 nm
Step Application Key tools for Cy5 channel
Step 1. Fix, permeabilize, and block Buffers
Step 2. Label Mitochondria
Cytoskeleton
Plasma membrane
Nucleus
Step 3. Detect Antibody direct labeling kits
Zenon kits
Streptavidin
SuperBoost TSA kits
Step 4. Protect and enhance Signal enhancer
Mountants and antifades
Step 5. Image Imaging and analysis

了解更多有关我们高内涵分析细胞成像系统产品线的信息

5-channel LED 系统 7-channel LED confocal 系统 7-channel laser confocal 系统

CellInsight CX5
非常适合正在寻找小巧经济型系统以扩大实验规模的实验室

查看试剂

CellInsight CX7
非常适合正在寻找更多成像模式选择的实验室


查看试剂

CellInsight CX7 LZR
非常适合正在努力提高灵敏度和速度性能的实验室


查看试剂

点击此处获取更多关于细胞成像系统的信息

基本的倒置透射光数字系统 高级倒置透射光数字系统 基本的荧光系统 高级荧光系统 全自动活细胞荧光系统

EVOS XL Core
适用于细胞培养和常规细胞维持

EVOS XL
适用于更高级的比色分析

EVOS FLoid
适用于快速荧光图像展示

EVOS FL
适用于多通道荧光成像和转染


EVOS FL Auto 2
适用于各类高级、自动化应用领域

固定细胞成像试剂选择表

EVOS DAPI Light Cube (AMEP4650)
Excitation: 357/44 nm;
Emission: 447/60 nm
EVOS GFP Light Cube (AMEP4651)
Excitation: 470/22 nm;
Emission: 510/42 nm
Step Application Key tools for GFP channel
Step 1. Fix, permeabilize, and block Buffers
Step 2. Label Mitochondria
Cytoskeleton
Plasma membrane
Nucleus
Step 3. Detect Antibody direct labeling kits
Zenon kits
Secondary antibodies
Streptavidin
SuperBoost TSA kits
Step 4. Protect and enhance Signal enhancer
Mountants and antifades
Step 5. Image Imaging and analysis
EVOS RFP Light Cube (AMEP4652)
Excitation: 531/40 nm;
Emission: 593/40 nm
Step Application Key tools for RFP channel
Step 1. Fix, permeabilize, and block Buffers
Step 2. Label Mitochondria
Cytoskeleton
Plasma membrane
Nucleus
Step 3. Detect Antibody direct labeling kits
Zenon kits
Streptavidin
SuperBoost TSA kits
Step 4. Protect and enhance Signal enhancer
Mountants and antifades
Step 5. Image Imaging and analysis
EVOS Texas Red Light Cube (AMEP4655)
Excitation: 585/29 nm;
Emission: 624/40 nm
EVOS Cy5 Light Cube (AMEP4656)
Excitation: 628/40 nm;
Emission: 693/40 nm
Step Application Key tools for Cy5 channel
Step 1. Fix, permeabilize, and block Buffers
Step 2. Label Mitochondria
Cytoskeleton
Plasma membrane
Nucleus
Step 3. Detect Antibody direct labeling kits
Zenon kits
Streptavidin
SuperBoost TSA kits
Step 4. Protect and enhance Signal enhancer
Mountants and antifades
Step 5. Image Imaging and analysis
EVOS DAPI Light Cube (AMEP4650)
Excitation: 357/44 nm;
Emission: 447/60 nm
EVOS GFP Light Cube (AMEP4651)
Excitation: 470/22 nm;
Emission: 510/42 nm
Step Application Key tools for GFP channel
Step 1. Fix, permeabilize, and block Buffers
Step 2. Label Mitochondria
Cytoskeleton
Plasma membrane
Nucleus
Step 3. Detect Antibody direct labeling kits
Zenon kits
Secondary antibodies
Streptavidin
SuperBoost TSA kits
Step 4. Protect and enhance Signal enhancer
Mountants and antifades
Step 5. Image Imaging and analysis
EVOS RFP Light Cube (AMEP4652)
Excitation: 531/40 nm;
Emission: 593/40 nm
Step Application Key tools for RFP channel
Step 1. Fix, permeabilize, and block Buffers
Step 2. Label Mitochondria
Cytoskeleton
Plasma membrane
Nucleus
Step 3. Detect Antibody direct labeling kits
Zenon kits
Streptavidin
SuperBoost TSA kits
Step 4. Protect and enhance Signal enhancer
Mountants and antifades
Step 5. Image Imaging and analysis
EVOS Texas Red Light Cube (AMEP4655)
Excitation: 585/29 nm;
Emission: 624/40 nm
EVOS Cy5 Light Cube (AMEP4656)
Excitation: 628/40 nm;
Emission: 693/40 nm
Step Application Key tools for Cy5 channel
Step 1. Fix, permeabilize, and block Buffers
Step 2. Label Mitochondria
Cytoskeleton
Plasma membrane
Nucleus
Step 3. Detect Antibody direct labeling kits
Zenon kits
Streptavidin
SuperBoost TSA kits
Step 4. Protect and enhance Signal enhancer
Mountants and antifades
Step 5. Image Imaging and analysis

了解更多有关我们高内涵分析细胞成像系统产品线的信息

5-channel LED 系统 7-channel LED confocal 系统 7-channel laser confocal 系统

CellInsight CX5
非常适合正在寻找小巧经济型系统以扩大实验规模的实验室

查看试剂

CellInsight CX7
非常适合正在寻找更多成像模式选择的实验室


查看试剂

CellInsight CX7 LZR
非常适合正在努力提高灵敏度和速度性能的实验室


查看试剂

五步法高品质固定细胞成像 - 5.1成像平台硬件
实验的第五步是实际成像。为了采集高品质图像,您需要一个具有顶级成像功能的成像平台。这里,我们介绍了获得最佳图像的硬件注意事项。

五步法高品质固定细胞成像 - 5.2成像平台软件
在显微镜上拍摄图像通常需要特定类型的成像软件,这种软件有助于拍摄图像并帮助将不同颜色的图像融合在一起。在获取出版级图像时,有一些非常重要的注意事项。

五步法高品质固定细胞成像 - 5.3使用EVOS FL Auto 2.0采集图像
这里讨论了使用EVOS FL Auto 2.0成像系统采集图像的优势。

五步法高品质固定细胞成像 - 5.4使用Celleste软件进行图像分析
以下总结了Celleste软件的功能,并介绍了在不同软件程序中处理图像的注意事项。

五步法高品质固定细胞成像 - 5.5其他注意事项
伦理成像即意味着数据值得信赖,也就是出版级的数据。以下阐述了如何处理您的样本和数据以确保数据完整性。

步骤一:细胞和组织样本处理

为实现最佳的图像质量,首先应建立针对目的蛋白和细胞结构的研究,同时将其他一切背景等排除在图像之外。固定和破膜细胞样本用于标记 – 首先将细胞结构、蛋白和核酸固定,然后使荧光染料和抗体渗入到细胞内部,标记目的靶点。封闭细胞样本,防止荧光标记物与研究无关的蛋白非特异性结合,最大限度提高信噪比。

Stained cell images, with and without optimized fixation

在固定和破膜之后,使用NucBlue活细胞染料及ActinGreen 488 ReadyProbes即用型试剂对U2OS细胞进行染色。图A采用传统甲醇溶液方法固定,图B则采用基于甲醛优化配方的Image-iT固定/透化试剂盒固定。对比可发现,图A中甲醇固定的方法可导致肌动蛋白细胞骨架断裂和细胞破碎,而Image-iT 固定/透化试剂盒则可为绝大多数细胞类型提供最佳固定条件。

产品 描述 货号
Image-iT固定/透化试剂盒
  • 固定:高纯度的4%福尔马林PBS溶液,pH 7.3
  • 透化液:0.5% Triton X-100
  • 封闭液:3% BSA,fraction V,脱脂,产自新西兰,DPBS溶液
  • 洗涤液:pH 7.4
R37602
BlockAid封闭液 50 mL B10710

五步法高品质固定细胞成像 - 1.1培养条件
获得高品质图像的第一步是样本制备。对于培养的细胞,细胞必须具有良好的健康状态和形态,以及恰好的融合度。健康的细胞即是获得优质数据的基础。

五步法高品质固定细胞成像 - 1.2固定
样本制备的下一步是固定。固定是指杀死细胞并保留其特定生理状态的化学方法,在多数情况下就是保护细胞形态。采用合适的固定方法才能保护靶点。

五步法高品质固定细胞成像 - 1.3透化
下一步是细胞透化,这是打开细胞内标记的关键步骤。

五步法高品质固定细胞成像 - 1.4封闭
透化的下一步是封闭。封闭方法有很多种,蛋白质封闭相当于特殊的抗体结合。染料电荷封闭即减少非特异性结合。

五步法高品质固定细胞成像 - 1.5自发荧光
细胞制备的最后一步是消除自发荧光。 细胞和组织具有一定程度的自发荧光,这可能会干扰特定信号并降低信噪比,消除自发荧光可提高灵敏度。

步骤二:标记样本

通过不同颜色荧光标记不同的靶标,可以直观的观察同一样本细胞内不同结构和蛋白。荧光标记靶标的方法主要包括荧光染料、免疫标记、荧光融合蛋白等——这几种方法均可选择性标记细胞内的结构和蛋白,让您在成像时更轻松地进行观察。细胞生物学采用的很多荧光工具基本上都是荧光基团。这些荧光基团经过不同的方法修饰或结合到不同的分子上,从而具备了某些的功能与特定的细胞器或蛋白结合。通过化学修饰,单个荧光基团可以产生许多变体形式,且每种变体都有不同的特异性。例如,发出绿色荧光的Invitrogen Alexa Fluor 488染料分子经过修饰后,可以靶向肌动蛋白微丝,可以结合IgG用于免疫标记,还可用作全细胞染料。Invitrogen提供了超过51000种高品质一抗,其中的部分抗体可以直接结合大量明亮的荧光染料和标记物,包括Invitrogen Alexa Fluor染料系列。访问 thermofisher.com/primaryantibodies了解我们丰富的荧光染料产品。

ActinGreen488 mitoSecAbAF750

采用Invitrogen Image-iT 固定/透化试剂盒制备染色用的培养细胞,然后采用Invitrogen BlockAid封闭液处理。先采用能识别线粒体的一抗标记样品,然后与Alexa Fluor 750 染料标记的二抗 (紫色),Invitrogen NucBlue细胞核染料(蓝色) 和Invitrogen ActinGreen 488即用型试剂(绿色)孵育。在Invitrogen EVOS FL全自动细胞成像系统上采集图像。

五步法高品质固定细胞成像 - 2.1一抗选择
样本制备完成后,获得出版级图像的第二步是标记样本,通常涉及到目标靶点的一抗。

五步法高品质固定细胞成像 - 2.2一抗方案优化
每个一抗都必须单独优化,有许多方案可供选择。不优化直接使用可能会导致很差的结果,因为每种抗体都略有不同,这一点非常重要。

步骤三:检测样本

检测复杂的生物学结构需要最高清晰度的荧光信号,并将荧光信号从背景噪声中分离开来。标准的免疫荧光标记很少能够获得最佳信噪比的成像效果。获得良好图片和极佳的可供发表的高质量图像之间的差异就在于:需要精细调整样品信号达到峰值特异性、高清晰度和最佳放大倍数。

轻松、快速选择所需的标记溶液

Lg superboost multiplex icc/ihc

固定和破膜HeLa细胞,采用Image-iT固定/透化试剂盒之中的试剂处理,与抗微管蛋白一抗及Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG (H+L) 二抗一同孵育。然后将细胞与抗ATP 合成酶亚型 IF1 抗体一同孵育,并采用Alexa Fluor 594 Tyramide SuperBoost 试剂盒(山羊抗小鼠IgG 和 Alexa Fluor 594酪胺)中的试剂进行标记。用NucBlue 可固定细胞即用型染料标记细胞核。采用共聚焦显微镜采集图像。

中等至高丰度的蛋白靶标

二抗可用于间接检测目的抗原。一抗与靶标直接结合,而二抗则以一抗为桥梁,间接结合目标生物分子。这种方法可以放大信号,提高灵敏度,最大限度的检测出靶标。
查找二抗

中等至低丰度的蛋白靶标

链霉亲和素结合物可以提高标记靶标的荧光基团的数量,从而放大信号。基于链霉亲和素信号放大技术广泛应用于荧光成像,用以提高一抗和二抗检测的灵敏度。
进一步了解链酶亲和素信号放大技术用于成像

低丰度蛋白靶标

对于传统方法无法检测到的低丰度蛋白靶标,酪胺信号放大技术(TSA)可以在不降低分辨率的前提下,进行灵敏的检测。TSA技术采用了一种能在过氧化氢存在的条件下释放活性染料的酶,从而使靶标明显且清晰的与背景区分开。
详细了解如何采用TSA技术对低丰度靶标成像

五步法高品质固定细胞成像 - 3.1二抗选择
获得出版级图像的第三步是检测标记。也就是使用二抗或信号放大技术等进行检测,并确定使用哪种对照。我们介绍了多种可选方案。

五步法高品质固定细胞成像 - 3.2二抗优化
二抗检测方案也需要针对所使用的每种一抗进行优化。

五步法高品质固定细胞成像 - 3.3信号放大技术
如果常规的二抗方案信号不够强,您可以采用信号放大技术来增强信号。这对于样品中的低表达抗原或稀有细胞检测尤为重要。

五步法高品质固定细胞成像 - 3.4对照
研究人员应设置所有必要的对照实验,以排除出现非特异性结合或非特异性信号的可能性。我们介绍了各种对照类型。适当的对照可以提高最终结果的可信度。

五步法高品质固定细胞成像 - 3.5染料选择和特殊注意事项
有许多不同染料可供选择,涵盖可见光、远红光和红外波长。以下所述注意事项有助于您在实验中做出最佳的选择。

步骤四:保护样本

虽然荧光基团是进行高质量细胞成像的最佳选择,但不可避免地也极易发生光漂白,即荧光信号的光化学降解或衰退。任何光敏感度的下降都可能导致数据出现偏差,产生假性结果。抗淬灭封片剂可以保护荧光标记蛋白的稳定性,维持数周乃至数月的图像信号完整度。

ProLong抗淬灭封片剂用于固定细胞成像具有以下好处:

  • 即使在长时间储存后,仍可以在整个光谱范围内抑制光漂白
  • 在整个光谱范围内的背景都很低
  • 固化封片剂
  • 可选含有或不含DAPI两种形式
  • 即用型随取随用优化配方
  • 可根据您的需求选择折射率:ProLong Glass试剂为1.52,ProLong Diamond和ProLong Gold试剂为1.47

了解更多用于固定细胞成像的Invitrogen ProLong抗淬灭剂

multipanel image series showing fluorescence stained cell following repeated illumination

60秒延时成像显示,使用ProLong抗淬灭封片剂能够提高对光漂白的抵抗性。使用FITC鬼笔环肽标记固定的HeLa细胞,并使用ProLong Glass试剂ProLong Diamond试剂ProLong Gold试剂或50% PBS/甘油封片。在使用标准100瓦汞弧灯连续照明的条件下,使用20倍物镜以12秒间隔采集图像。

推荐科学海报

抗淬灭封片剂有助于改善3D生物样本的成像质量。

下载海报

五步法高品质固定细胞成像 - 4.1封片剂
使用正确的封片剂将改善您的实验。请一定为您的成像选择合适的封片剂。

五步法高品质固定细胞成像 - 4.2光漂白和抗淬灭
什么是光漂白?如何防止光漂白破坏您的样品?为您介绍多种抗淬灭剂选择指南。

步骤五:样本成像

通过采集最高清晰度图像突破研究新发现。在当今激烈的科研竞争环境下,能否快速获得可供发表的高质量图像是决定您成败的关键。想要获取最顶级的图像,就需要配备顶级成像元件的成像平台,包括:

  • 高品质照机和光学元件,采集高分辨率图像
  • LED光立方,获得出众的信噪比
  • 简单易用的图像采集和处理软件,直接获得可供发表的图像

通过比较以下成像系统,找到最适合您的成像需求的一款产品。

点击此处获取更多关于细胞成像系统的信息

基本的倒置透射光数字系统 高级倒置透射光数字系统 基本的荧光系统 高级荧光系统 全自动活细胞荧光系统

EVOS XL Core
适用于细胞培养和常规细胞维持

EVOS XL
适用于更高级的比色分析

EVOS FLoid
适用于快速荧光图像展示

EVOS FL
适用于多通道荧光成像和转染


EVOS FL Auto 2
适用于各类高级、自动化应用领域

固定细胞成像试剂选择表

EVOS DAPI Light Cube (AMEP4650)
Excitation: 357/44 nm;
Emission: 447/60 nm
EVOS GFP Light Cube (AMEP4651)
Excitation: 470/22 nm;
Emission: 510/42 nm
Step Application Key tools for GFP channel
Step 1. Fix, permeabilize, and block Buffers
Step 2. Label Mitochondria
Cytoskeleton
Plasma membrane
Nucleus
Step 3. Detect Antibody direct labeling kits
Zenon kits
Secondary antibodies
Streptavidin
SuperBoost TSA kits
Step 4. Protect and enhance Signal enhancer
Mountants and antifades
Step 5. Image Imaging and analysis
EVOS RFP Light Cube (AMEP4652)
Excitation: 531/40 nm;
Emission: 593/40 nm
Step Application Key tools for RFP channel
Step 1. Fix, permeabilize, and block Buffers
Step 2. Label Mitochondria
Cytoskeleton
Plasma membrane
Nucleus
Step 3. Detect Antibody direct labeling kits
Zenon kits
Streptavidin
SuperBoost TSA kits
Step 4. Protect and enhance Signal enhancer
Mountants and antifades
Step 5. Image Imaging and analysis
EVOS Texas Red Light Cube (AMEP4655)
Excitation: 585/29 nm;
Emission: 624/40 nm
EVOS Cy5 Light Cube (AMEP4656)
Excitation: 628/40 nm;
Emission: 693/40 nm
Step Application Key tools for Cy5 channel
Step 1. Fix, permeabilize, and block Buffers
Step 2. Label Mitochondria
Cytoskeleton
Plasma membrane
Nucleus
Step 3. Detect Antibody direct labeling kits
Zenon kits
Streptavidin
SuperBoost TSA kits
Step 4. Protect and enhance Signal enhancer
Mountants and antifades
Step 5. Image Imaging and analysis
EVOS DAPI Light Cube (AMEP4650)
Excitation: 357/44 nm;
Emission: 447/60 nm
EVOS GFP Light Cube (AMEP4651)
Excitation: 470/22 nm;
Emission: 510/42 nm
Step Application Key tools for GFP channel
Step 1. Fix, permeabilize, and block Buffers
Step 2. Label Mitochondria
Cytoskeleton
Plasma membrane
Nucleus
Step 3. Detect Antibody direct labeling kits
Zenon kits
Secondary antibodies
Streptavidin
SuperBoost TSA kits
Step 4. Protect and enhance Signal enhancer
Mountants and antifades
Step 5. Image Imaging and analysis
EVOS RFP Light Cube (AMEP4652)
Excitation: 531/40 nm;
Emission: 593/40 nm
Step Application Key tools for RFP channel
Step 1. Fix, permeabilize, and block Buffers
Step 2. Label Mitochondria
Cytoskeleton
Plasma membrane
Nucleus
Step 3. Detect Antibody direct labeling kits
Zenon kits
Streptavidin
SuperBoost TSA kits
Step 4. Protect and enhance Signal enhancer
Mountants and antifades
Step 5. Image Imaging and analysis
EVOS Texas Red Light Cube (AMEP4655)
Excitation: 585/29 nm;
Emission: 624/40 nm
EVOS Cy5 Light Cube (AMEP4656)
Excitation: 628/40 nm;
Emission: 693/40 nm
Step Application Key tools for Cy5 channel
Step 1. Fix, permeabilize, and block Buffers
Step 2. Label Mitochondria
Cytoskeleton
Plasma membrane
Nucleus
Step 3. Detect Antibody direct labeling kits
Zenon kits
Streptavidin
SuperBoost TSA kits
Step 4. Protect and enhance Signal enhancer
Mountants and antifades
Step 5. Image Imaging and analysis

了解更多有关我们高内涵分析细胞成像系统产品线的信息

5-channel LED 系统 7-channel LED confocal 系统 7-channel laser confocal 系统

CellInsight CX5
非常适合正在寻找小巧经济型系统以扩大实验规模的实验室

查看试剂

CellInsight CX7
非常适合正在寻找更多成像模式选择的实验室


查看试剂

CellInsight CX7 LZR
非常适合正在努力提高灵敏度和速度性能的实验室


查看试剂

点击此处获取更多关于细胞成像系统的信息

基本的倒置透射光数字系统 高级倒置透射光数字系统 基本的荧光系统 高级荧光系统 全自动活细胞荧光系统

EVOS XL Core
适用于细胞培养和常规细胞维持

EVOS XL
适用于更高级的比色分析

EVOS FLoid
适用于快速荧光图像展示

EVOS FL
适用于多通道荧光成像和转染


EVOS FL Auto 2
适用于各类高级、自动化应用领域

固定细胞成像试剂选择表

EVOS DAPI Light Cube (AMEP4650)
Excitation: 357/44 nm;
Emission: 447/60 nm
EVOS GFP Light Cube (AMEP4651)
Excitation: 470/22 nm;
Emission: 510/42 nm
Step Application Key tools for GFP channel
Step 1. Fix, permeabilize, and block Buffers
Step 2. Label Mitochondria
Cytoskeleton
Plasma membrane
Nucleus
Step 3. Detect Antibody direct labeling kits
Zenon kits
Secondary antibodies
Streptavidin
SuperBoost TSA kits
Step 4. Protect and enhance Signal enhancer
Mountants and antifades
Step 5. Image Imaging and analysis
EVOS RFP Light Cube (AMEP4652)
Excitation: 531/40 nm;
Emission: 593/40 nm
Step Application Key tools for RFP channel
Step 1. Fix, permeabilize, and block Buffers
Step 2. Label Mitochondria
Cytoskeleton
Plasma membrane
Nucleus
Step 3. Detect Antibody direct labeling kits
Zenon kits
Streptavidin
SuperBoost TSA kits
Step 4. Protect and enhance Signal enhancer
Mountants and antifades
Step 5. Image Imaging and analysis
EVOS Texas Red Light Cube (AMEP4655)
Excitation: 585/29 nm;
Emission: 624/40 nm
EVOS Cy5 Light Cube (AMEP4656)
Excitation: 628/40 nm;
Emission: 693/40 nm
Step Application Key tools for Cy5 channel
Step 1. Fix, permeabilize, and block Buffers
Step 2. Label Mitochondria
Cytoskeleton
Plasma membrane
Nucleus
Step 3. Detect Antibody direct labeling kits
Zenon kits
Streptavidin
SuperBoost TSA kits
Step 4. Protect and enhance Signal enhancer
Mountants and antifades
Step 5. Image Imaging and analysis